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目的：探讨HepG2.2.15细胞在增殖和凋亡过程中细胞内乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价、闭合、环状DNA(covalentlyclosed circular DNA，cccDNA)的变化规律,并了解HBVcccDNA、HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surfaceantigen，HBsAg)和乙型肝炎e抗原(hepatitis Beantigen,HBeAg)变化的相互关系。
材料与方法：
1.设计特异性引物和Taqman探针、构建质粒、制备标准品,建立检测HBV cccDNh、HBV总DNA(total DNA,tDNA)和基因组甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因的荧光定量PCR(fluorescent quantitativepolymerase chain reaction，FQ-PCR)方法。
2.HepG2.2.15细胞增殖对细胞内HBV cccDNA的影响:HepG2.2.15细胞进入对数生长期后,以阿菲迪霉素(Aphidicolin)抑制细胞增殖,以其溶剂(DMSO)建立细胞增殖模型,并分别以思替卡韦(entecavir，ETV)抑制细胞内HBV DNA的复制。在不同时间点收集细胞后,分别检测细胞内HBV cccDNA、HBV tDNA、GPADH基因和上清中HBV tDNA、HBsAg、HBeAg,然后分析各组的变化规律及相互关系。实验分两个部分进行。
1)各实验组随时间的动态变化:在加药后5天内,每天收集细胞。
2)各实验组间的比较:每个实验组用10瓶细胞,加药后第2天全部收集。
3.HepG2.2.15细胞凋亡对细胞内HBV cccDNA的影响:HepG2.2.15细胞进入对数生长期后,以放线菌素D(actinomycin D，Act D)诱导细胞凋亡,以溶剂(DMSO)作为对照组,建立细胞凋亡模型,分别在O、4、8、24、48小时收集细胞,以流式细胞术检测细胞凋亡率,并检测细胞内HBV cccDNA、HBV tDNA、GPADH基因和上清中HBVtDNA、HBsAg、HBeAg。
结论：
1.HBV感染细胞的增殖和凋亡是细胞内HBV cccDNA减少的重要机制,ETV对细胞内cccDNA未显示出直接影响。
2.细胞内DNA积聚和抗原分泌的顺序为:细胞内HBV tDNA>细胞内HBV cccDNA>上清HBV tDNA；上清HBsAg≥细胞内HBV cccDNA>上清HBeAg。而在ETV作用过程中,HBV DNA减少的顺序为:上清HBVtDNA>细胞内HBV tDNA>细胞内HBV cccDNA。
3.在细胞体外培养体系中,细胞数标准化的上清HBsAg和HBeAg均能作为细胞内HBV cccDNA的替代指标。