【摘 要】
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提取花生总RNA,用特异性引物,RT-PCR扩增得到Arah2.02基因序列,将该序列克隆至pMD 19-T Simple Vector中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h 2.02,重组质粒进行双酶切鉴定并测序
【机 构】
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上海大学生命科学学院,上海100280
【出 处】
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第五届长江三角洲地区植物学学术研讨会
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提取花生总RNA,用特异性引物,RT-PCR扩增得到Arah2.02基因序列,将该序列克隆至pMD 19-T Simple Vector中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h 2.02,重组质粒进行双酶切鉴定并测序,将测序正确的片段定向克隆到pET-32a(+)原核表达载体中,构建表达重组质粒pET-32a(+)-Ara h 2.02,并转化宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白的相对分子质量约为38000.进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Ara h 2.02.为获得较多的重组蛋白Ara h 2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为：IPTG浓度0.3 mmol/L,摇床转速220 r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h.
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