【摘 要】
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目的 建立和验证用于巨细胞病毒(CMV)启动子序列检测的复合定量PCR方法.方法 以CMV启动子序列和小鼠管家基因β-actin的cDNA序列为模版分别设计探针和引物,用SYBR Green Ⅰ熔解曲线分析两对引物扩增的特异性.对反应体系进行系统优化,并验证检测方法的灵敏度、线性和重复性、以及复合反应效率的变化.结果 针对CMV启动子序列的上游引物为5AGACTTG GAAATCCCCGTGAGT
【机 构】
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中国食品药品检定研究院,北京100176
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目的 建立和验证用于巨细胞病毒(CMV)启动子序列检测的复合定量PCR方法.方法 以CMV启动子序列和小鼠管家基因β-actin的cDNA序列为模版分别设计探针和引物,用SYBR Green Ⅰ熔解曲线分析两对引物扩增的特异性.对反应体系进行系统优化,并验证检测方法的灵敏度、线性和重复性、以及复合反应效率的变化.结果 针对CMV启动子序列的上游引物为5AGACTTG GAAATCCCCGTGAGT3,下游引物为5 CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGT3,探针为5AACCGCTATCCACGCCCATTGATG3.针对β-actin的上游引物为5CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC3,下游引物为5TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3 ,探针为5 TCCTTCTTGGGTATG GAATCCTGTGGC3.引物、探针、酶和Mg2+浓度都优化到最佳浓度.用CMV启动子标准品制作的标准曲线,反应效率为100％,相关系数为0.9978,定量范围达到1.5 ×102 ～1.5×107 copies,反应体系灵敏度为30 copies.相比于单独PCR反应,基因治疗产品与β-actin标准品复合PCR反应后扩增效率有所降低.结论 建立了检测CMV启动子序列的复合实时定量PCR方法.
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