【摘 要】
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引言 鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMBV)属于黄病毒科(Flaviviridae)病毒,基因组为单股正链RNA,长约11kb,由2个非编码区(untranslated regions,UTRs)和1个编码区(open reading frame,ORF)组成[1].ORF编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白(nonstructural protein,NS),分别是衣壳蛋白
【机 构】
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四川农业大学预防兽医研究所,四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,四川成都,611130
【出 处】
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2015中国第三届水禽疫病防控研讨会
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引言 鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMBV)属于黄病毒科(Flaviviridae)病毒,基因组为单股正链RNA,长约11kb,由2个非编码区(untranslated regions,UTRs)和1个编码区(open reading frame,ORF)组成[1].ORF编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白(nonstructural protein,NS),分别是衣壳蛋白C,囊膜蛋白prM/M,囊膜蛋白E,NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5[2].本研究以DTMBV的主要囊膜蛋白E蛋白为着手点,制备E蛋白的多克隆抗体,为探讨DTMBV在真核细胞内的包装加工奠定基础.材料与方法 本研究涉及的毒株为DTMBV WR株,是由福建农业科学院黄瑜老师提供.根据DTMBV WR株序列(GenBank JX196334.1)设计扩增E基因的引物,PCR扩增后连入T克隆载体,挑选阳性菌落送测序.通过酶切方法,将目的片段从T载体上酶切,连接入原核表达载体pET32a(+),并转化入DH5α中,命名为DH5α(pET32a-E),经质粒小量抽提试剂盒(天根)抽提质粒,酶切鉴定.将pET32a-E质粒转化入原核表达菌Rosetta(DE3)中,命名为Rosetta(pET32a-E),IPTG诱导,Ni纯化后,获得的E蛋白以0.4mg/kg的剂量免疫新西兰大耳兔,分别间隔14d/次,共免疫四次,于第四次免疫后10d收集兔血清,为所制备的兔抗E多克隆抗体.将E蛋白作为抗原,利用琼扩方法检测所制备多克隆抗体的生物活性.结果与讨论 T克隆后测序获得1503bp的基因,与NCBI上发表的E基因碱基组成相同,表明E基因T克隆成功.构建的pET32a-E经酶切鉴定,在Marker Ⅲ(天根)指示约1500bp处有片段出现,与预期大小符合,表明原核表达质粒构建成功.IPTG诱导Rosetta(pET32a-E),经Ni纯化后,SDS-PAGE分析显示在约65kD处有目的蛋白出现,与预期大小符合,表明E蛋白在原核表达系统中成功表达.将纯化的E蛋白免疫新西兰大耳兔后,利用琼扩的方法测定兔抗E多克隆抗体效价,发现在1：2、1：4、1：8、1：16和1：32处均有沉淀线,表明所制备的兔抗E多克隆抗体能与E蛋白反应,具有生物活性,兔抗E蛋白多克隆抗体制备成功.
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