【摘 要】
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本研究旨在克隆贝氏隐孢子虫Rhomboid基因,构建真核表达载体,对重组载体在真核细胞中的表达进行了研究.将GenBank中发表的C.parvum、C.hominis和C.Muris的Rhomboid基因序列比对分析,设计合成该基因保守片段的1对引物,以贝氏隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增出CbROM基因保守片段,采用染色体步移技术与生物信息学分析,得到完整的CbROM基因,克隆至pMD 1
【机 构】
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浙江大学动物科学学院动物医学系,杭州310058
【出 处】
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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第七次代表大会暨第十二次学术研讨会
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本研究旨在克隆贝氏隐孢子虫Rhomboid基因,构建真核表达载体,对重组载体在真核细胞中的表达进行了研究.将GenBank中发表的C.parvum、C.hominis和C.Muris的Rhomboid基因序列比对分析,设计合成该基因保守片段的1对引物,以贝氏隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增出CbROM基因保守片段,采用染色体步移技术与生物信息学分析,得到完整的CbROM基因,克隆至pMD 18-TSimple载体,测序鉴定正确后,经SacⅠ和KpnⅠ双酶切,亚克隆至pEG-FP-C2真核表达载体,构建pEGFP-C2-CbROM重组表达质粒；采用脂质体介导法,将鉴定为阳性的重组质粒转染至HEK293细胞；通过荧光显微镜观察,SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测CbROM基因在HEK293细胞中的表达.结果表明,扩增的CbROM基因保守片段长度为359bp,与GenBank中发表的C.parvum Rhomboid核苷酸序列相似性为96％,通过染色体步移技术和开放阅读框预测,获得CbROM基因全长为1422bp;构建的真核表达质粒pEGFP-CbROM转染HEK293细胞24h后,在荧光显微镜下可观察到稳定的绿色荧光信号,SDS-PAGE电泳和Western blotting分析表达融合蛋白的分子量为52 kDa,具有较好的反应原性.结果提示,真核表达质粒pEGFP-CbROM得到成功构建,并能够在HEK293细胞中表达,为进一步研究贝氏隐孢子虫Rhomboid蛋白的生理功能,研发隐孢子虫核酸疫苗奠定了基础.
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