斑马鱼活性ZB转座子的挖掘及其应用研究

• 作 者: 沈丹 王赛赛 陈才 钟继汉 陈伟 高波 王宵燕 崔恒宓 宋成义
• 机 构: 扬州大学动物科学与技术学院,扬州大学表观遗传学与表观基因组学研究所,扬州225009
• 出 处: 第三届全国斑马鱼PI大会暨中国动物学会斑马鱼分会成立大会
• 发表日期: 2016年9期
• 关键词: 转座子 转基因 转座活性 斑马鱼 小鼠 增强子捕获

　　DNA转座子是一种在生物界广泛分布,且能够在宿主基因组移动的DNA 元件,是一种重要的遗传操作工具.目前,PB,SB,Tol2 等DNA 转座子在转基因,基因捕获,基因治疗等领域应用广泛,但目前国内具有自主知识产权的转座子的研究相对缺乏.本研究通过生物信息学分析,在斑马鱼基因组中发现5 个结构完整的Tc1/Mariner 家族DNA转座子(图A).经遗传分化比较(图B),表明其中1 个转座子是年轻转座子,可能具有较高的活性,命名为ZB.完整ZB 转座子全长1.4kb,两端各有一个对称的203bp 的末端反向重复序列,中间含有1026bp 的转座酶基因编码序列.将含PGK-NEO 表达盒的转座子质粒和转座酶表达质粒(pCMV-ZB)以不同质量比共转染Hela 细胞,进行转座活性验证,并与PB、SB 和Tol2 转座子进行比较.试验结果表明ZB 转座子在1∶1质量比时含抗性的细胞数量最多,即转座效率最高；且ZB 的转座效率略高于PB(P＞0.05),但显著高于SB 和Tol2(P＜0.05)(图C 和图D).将含FAG-GFP 表达盒的转座子质粒和转座酶mRNA 共注射斑马鱼一细胞期胚胎,通过荧光检测比较4 种转座子的转座效率,试验结果表明,在注射后24hpf 和5dpf 的GFP 阳性率ZB 转座子均高于其它3 种转座子(图E),且显著高于SB转座子(P＜0.05).将含CAG-GFP 表达盒的转座子质粒和转座酶共注射制备转基因小鼠,其效率约为33.33％.阳性首建鼠与野生型杂交后产生F1 代,在F1 代中检测到GFP 阳性鼠(图F),表明ZB 转座子能够有效介导外源基因在鼠生殖系细胞中传播.将含增强子捕获盒的转座子(pZB-En-trap)质粒和转座酶mRNA 共注射斑马鱼一细胞期胚胎,获得阳性斑马鱼F0 与野生型杂交,在F1 代检测到大量的GFP 阳性胚胎(图G),呈现多种组织或者细胞特异的表达模式(图H),提示ZB 介导的增强子捕获载体能够有效捕获增强子,其F0代到F1 代的生殖系传播效率为55.56％(NF0=108),表明ZB 转座子能够有效介导捕获增强子.本研究表明,新发现的ZB 转座子是高活性转座子,该转座子能够在哺乳动物细胞、小鼠和斑马鱼胚胎上高效介导外源基因转移,并能够有效介导增强子捕获,具有较好的应用前景.