【摘 要】
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本实验目的为建立一种能同时检测副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7四种食源性致病菌的多重PCR检测方法.分别对四种目标菌设计特异性引物,
【机 构】
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大连理工大学生命科学与技术学院 辽宁大连116024
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本实验目的为建立一种能同时检测副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7四种食源性致病菌的多重PCR检测方法.分别对四种目标菌设计特异性引物,优化多重PCR反应体系中的主要影响因素(退火温度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度及酶浓度).确定多重PCR反应体系及反应条件为10×PCR buffer 2.5μL,MgC12 (25 mmol/L)浓度为2.5mmol/L,dNTP (2.5mmol/L)浓度为0.35mmol/L,单增李斯特菌引物浓度为0.75mmol/L,大肠杆菌O157∶H7引物浓度为0.40mmol/L；副溶血性弧菌引物浓度为0.75mmol/L,金黄色葡萄球菌引物浓度为0.40mmol/L.病原菌DNA模板各1μL,Taq酶(5U/μL)活力为1.5U,加ddH王2O补充至25μL；反应程序为：95℃预变性3ain,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,进行32个循环,最后72℃终延伸10min,4℃保存.通过引物特异性试验及灵敏性实验,证明该方法具有较好的特异性,检出限为1.2×105 cfu/mL.建立了一个简捷、迅速,能同步检测食品中单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法.
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