【摘 要】
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[目的]CRISPR/Cas9系统具灵活性及适应性,在基因功能分析,基因编辑生物,转录调控以及基因治疗等方面发挥巨大潜能.得益于基因组测序以及生物信息学的研究,可以迅速对基因进行定位分析.然而我们面对的更大需求及挑战是如何解析基因调控表型的分子机理,尤其在非模式物种中,这种需求尤为迫切.小菜蛾属世界性害虫,其抗性发展机制,抗性治理及遗传防治方面的研究,备受瞩目,CRISPR/Cas系统是实现这些研
【机 构】
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福建农林大学闽台作物有害生物防控国家重点实验室,福州,350002;福建农林大学应用生态研究所,福州,350002;闽台特色作物病虫生态防控协同创新中心,福州,350002;农业部闽台作物有害生物综合
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[目的]CRISPR/Cas9系统具灵活性及适应性,在基因功能分析,基因编辑生物,转录调控以及基因治疗等方面发挥巨大潜能.得益于基因组测序以及生物信息学的研究,可以迅速对基因进行定位分析.然而我们面对的更大需求及挑战是如何解析基因调控表型的分子机理,尤其在非模式物种中,这种需求尤为迫切.小菜蛾属世界性害虫,其抗性发展机制,抗性治理及遗传防治方面的研究,备受瞩目,CRISPR/Cas系统是实现这些研究行之有效的方法之一.本研究以Pxabd-A为对象,验证CRISPR/Cas9系统在小菜蛾中的编辑效率,并分析该基因在小菜蛾发育过程中的功能.[方法]克隆鉴定Pxabd-A,并利用荧光定量PCR分析该基因在不同发育阶段的表达水平；分析鉴定小菜蛾内源U6启动子,构建U6-sgRNA表达载体；采用显微注射的方法,将Cas9 mRNA和sgRNA/U6-sgRNA注射于胚胎中,分析注射后小菜蛾的变化.[结果]Pxabd-A在小菜蛾中存在两种剪切体：isoformA与isoformB.该基因在小菜蛾的不同发育时期均有表达,蛹和成虫表达量相对较高.直接注射Cas9 mRNA与abd-A-sgRNA后,91％的G0个体呈现腹节,腹足以及生殖器的畸形,且突变的表型可稳定遗传至G1个体.G1个体的基因型分析表明,CRISPR/Cas9系统介导Pxab d-A靶点的高效切割,DNA双链断裂后非同源末端的修复导致靶点发生插入或缺失.共注射DBMU6-sgRNA表达质粒与Cas9 mRNA,G0个体呈现腹节和腹足的畸形与直接注射sgRNA的表型相一致.序列的突变分析结果表明,靶点序列存在点突变,插入与缺失,大片段的删除,有些个体缺失了两个靶点之间的～28kb的序列.[结论]小菜蛾内源性的U6启动子能高效的驱动sgRNA表达,CRISPR/Cas9系统有效地对Pxabd-A进行基因编辑,敲除后突变的小菜蛾呈现腹节,腹足以及生殖器的畸形,并能稳定遗传至G1个体.本研究为CRISPR/Cas系统在小菜蛾基因功能研究及寻求遗传防治策略奠定基础.
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