成体骨髓源多能间充质干细胞移植后参与体内组织再生与修复的研究

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目的:探讨成体骨髓源多能间充质干细胞在康复医学中的应用前景。对象与方法:1、分离小鼠骨髓单个核细胞,经特殊培养基培养,获得Flk-1+骨髓源间充质干细胞;2、动物模型的建立:雌性C57BL/6小鼠致死量照射后移植同基因骨髓细胞和BALB/C骨髓源间充质干细胞,长期观察并检测该异基因间充质干细胞在受体鼠体内的分布及分化情况;3、分离、培养人胎儿骨髓源多能间充质干细胞,检测其免疫表型,鉴定其多向分化潜能;4、将受体雌性NOD/SCID小鼠预先经铯源全身照射300cGy后在4小时内从尾静脉输入人胎儿骨髓源多能间充质干细胞(106/只),对照组小鼠则注射等体积RPMI 1640; 俩月后,将已证实骨髓中含有人源造血细胞的受体小鼠的骨髓细胞(2×107/只)经尾静脉输入经过照射的NOD/SCID小鼠体内(二次移植),并检测其植入情况。结果:1、骨髓源多能间充质干细胞主要的免疫表型:CD34-,H-2Kd-(MHCⅠ)和I-Ad-(MHC Ⅱ);黏附分子CD29,CD44高表达;CD13低表达;Flk-1+高表达;在适当的诱导条件下该细胞可向脂肪、成骨和软骨细胞分化;2、将5×105 供体BALB/C骨髓源多能间充质干细胞和一定量的C57BL/6小鼠骨髓细胞共同植入经致死量照射的成年C57BL/6小鼠,40天后,观察到受体小鼠背部出现白色毛发,并且随着时间的推移而逐渐扩展(Stem cell and Cellular Therapy 2003;1(1)62-65)。皮肤组化显示:试验组C57BL/6小鼠毛囊中未见有黑色毛发片段,且在表皮和真皮层的毛囊周围可见棕黄色的H-2Kd阳性细胞,提示这些细胞为BALB/C小鼠来源;双标组化显示:阳性对照组切片中在毛囊部位含有皮肤干细胞处可见明显双阳性组织细胞(P63+、H-2K6+);皮肤细胞涂片双标组化结果亦证实有双阳性细胞(P63+、H-2K6+);RT-PCR结果进一步从分子水平说明被测组织为H-2Kd阳性小鼠来源;3、用CD45、GIyA及CD34免疫磁珠阴性选择Ficoll-Paque分离液分离得到的低密度胎儿骨髓源单个核细胞后,通过极限稀释法获得单克隆细胞,以特殊培养基培养进行体外扩增,得到的单克隆细胞在传代过程中保持CD34、CD45、CD31、vWF、GlyA、CDlla、CDllb阴性(The Journal of Laboratoryand Clinical Medicine.2003 May;141(5):342-9),而Flk1+高表达(99%以上)。在适当的诱导条件下可向脂肪、成骨、软骨、内皮、肝实质、神经及造血细胞分化。4、接受移植后2个月,检测(流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR)结果显示该人源间充质于细胞参与小鼠的造血重建:5、三色免疫荧光显示:在大多数受体鼠体内(小肠、肝、肺等组织)都能检测到表达人内皮细胞表面标志vWF的细胞,它们参与受体微血管损伤的修复(Exp Hematol.2003 Jul;31(7):650-8);6、在受体的气管、肺、消化道和肝中,检测到供体来源的上皮细胞或肝细胞,这一结果亦得到RT-PCR的证实。Western Blot示受体小鼠血清中含有人源ALB,RT-PCR证实其肝细胞有人ALB mRNA表达(Joumalof Hematotherapy&Stem Cell Research)。7、在二次移植俩个月后,在受体小鼠的骨髓、脾、气管、肺、肝和消化道中,同样也检测到人源细胞。结论:1、异体骨髓多能间充质干细胞植入体内可再生皮肤组织细胞;胎儿骨髓源多能间充质干细胞细胞具有高度的自我更新及分化潜能,在体内不仅能够参与造血重建及微血管损伤的修复,而且还能分化气管、肺、消化道的上皮细胞以及肝细胞;2、成体骨髓源多能间充质干细胞是一种理想的用于组织修复的种子细胞;干细胞临床移植在康复医学中必将具有广阔的潜在应用前景。
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