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玉米大斑病是玉米生产上的重要病害,流行年份常给玉米生产造成重大经济损失。该病害的致病菌为玉米大斑病菌(Setosphaesia turcica),深入研究调控病菌侵染及致病的分子机制对于选择更有效的防治措施具有重要意义。在植物病原真菌中的MAPK(mitogen activated prorein kinse)级联途径具有高度保守性,该途径由3个保守的蛋白激酶组成,分别为MAPKKK-MAPKK-MAPK,其上游的激酶可以通过磷酸化的方式激活下游激酶,从而调控细胞内的代谢过程。植物病原真菌的生长发育、侵染及致病性等均受MAPK细胞信号转导途径的调控。在前期研究中,我们利用生物信息学技术确定了在玉米大斑病菌中至少存在3条MAPK途径,分别为FUS3/KSS1-MAPK、HOG-MAPK、CWI-MAPK途径。利用JGI网站(http://www.jgi.doe.gov)上公布的玉米大斑病菌基因组序列和相应的注释信息从玉米大斑病菌基因组数据库中搜索得到了HOG-MAPK级联途径的MAPK基因,将其命名为STK1,并在GenBank上登录(登录号:AY849317)。该基因DNA全长为1506bp,cDNA全长为1071bp,编码356个氨基酸,有9个外显子和8个内含子。在此研究的基础上,我们以pBS载体为基本骨架,分析了STK1基因编码区序列上游2000bp和其下游2000bp的侧翼序列,以及草胺膦抗性基因Bar的酶切位点,采用Primer5.0软件设计引物,并在引物的5’端引入Xho I、EcoR I、Spe I、Sac I酶切位点,用于扩增该基因的上、下游片段和Bar基因序列,构建了该基因的敲除载体。利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化技术得到3株具有草胺膦抗性的菌株,在后续试验中我们将进一步用特异引物PCR、RT-PCR、Southern blotting等技术确定STK1靶基因敲除突变体,并通过比较突变体与野生型菌株在菌丝发育、对高渗胁迫的反应及致病性等方面的差异分析该基因的功能。该研究不仅能够初步明确玉米大斑病菌HOG-MAPK级联途径的功能,也为筛选杀菌剂作用的靶标奠定基础。