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建立了一种反相高效液相色谱分离,脉冲安培电化学法直接检测妥布霉素滴眼液含量的分析方法。采用自制的聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相柱,以NaOH(50 mmol/L)+乙腈(0.5%)溶液为流动相,不需要衍生化和柱后加碱。对分离及检测的各参数进行优化后,妥布霉素的保留时间为6.2 min,测定妥布霉素的线性范围为0.2~20 mg/L,线性相关系数为0.999 3,保留时间、峰面积和峰高的相对标准偏差分别为0.57%、1.31%和0.61%,检出限为9.97μg/L方法简单、快速、准确,可用于妥布霉素滴眼液含量测定。