【摘 要】
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目的 通过分析骨髓瘤骨病患者和正常对照组MSC 在成骨分化中的circRNA、LncRNA、mRNA、micro RNA差异性表达,并通差异性表达的micro RNA 进行生物信息学分析,寻找最可能的miRNA 及其靶基因,并进行相关的验证,从而明确microRNA 在骨髓瘤骨病MSC 成骨分化中的作用.首先收集多发性骨髓瘤合并骨髓瘤骨病患者骨髓和外周血标本作为实验组,选择正常人骨髓和外周血标本作
【机 构】
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陆军军医大学新桥医院全军血液病中心 创伤、烧伤与复合伤研究国家重点实验室,重庆市医学重点实验室 重庆市医学重点学科 重庆市血液内科医疗质量控制中心
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目的 通过分析骨髓瘤骨病患者和正常对照组MSC 在成骨分化中的circRNA、LncRNA、mRNA、micro RNA差异性表达,并通差异性表达的micro RNA 进行生物信息学分析,寻找最可能的miRNA 及其靶基因,并进行相关的验证,从而明确microRNA 在骨髓瘤骨病MSC 成骨分化中的作用.首先收集多发性骨髓瘤合并骨髓瘤骨病患者骨髓和外周血标本作为实验组,选择正常人骨髓和外周血标本作为对照组,实验组和对照组骨髓标本经流式细胞检测和鉴定骨髓瘤细胞和间充质干细胞,并分别鉴定在骨髓瘤骨病,并对骨髓瘤细胞和间充质干细胞进行免疫表型鉴定和分离,并对间充质干细胞进行富集和纯化；根据二代测序结果 ,分析差异性表达的circRNA、LncRNA、mRNA、micro RNA,根据生物信息学分析,将它们分别与靶基因构建了调节网络图；然后,挑选部分差异表达的RNA 进行成骨分化的验证试验.通过茜素红染色及 RT-qPCR 证实MM-MSC 与N-MSC 成骨细胞分化的差异,确定筛选出的micro RNA,RT-qPCR 分析来自MM-MSC 与N-MSC 中micro RNA 的表达水平.通过网络数据库,预测筛选出的micro RNA 可能结合的靶基因；荧光素酶试验确定筛选出的靶基因参与成骨分化；通过慢病毒载体过表达筛选出的靶基因,通过Western blot 分析其蛋白表达水平；通过Western blot 分析成骨分化相关通路的蛋白表达水平.结果 1.MM-MSC 与N-MSC 存在差异性表达的circRNA、LncRNA、mRNA、micro RNA,经过生物信息学分析,选择miR-203a-3p.1、miR-221-5p 进行成骨分化验证实验.2.成骨细胞诱导后miR-221-5p 在N-MSCs 中下调,而在MBD-MSCs 中未观察到明显变化. miR-221-5p 的抑制促进了MBD-MSC 的成骨分化.生物信息学,荧光素酶报告基因,RT-qPCR 和WB 分析表明,smad3 是miR-221-5p 在MBD-MSCs 中的直接靶标.在smad3 和miR-221-5p 的表达水平之间呈负相关.miR-221-5p 可通过上调smad3 调节MBD-MSCs 的成骨分化.miR-221-5p 抑制后激活PI3K/Akt/mTOR 传导途径增加MBD-MSC 的成骨分化能力.3.与N-MSC 相比,MM-MSC 的成骨分化能力降低.研究表明miR-203a-3p.1 在成骨细胞诱导后在NMSC中下调,而在MM-MSC 中没有观察到明显的变化. miR-203a-3p.1 的下调导致成骨分化潜能增加,表现为典型成骨细胞分化标志物mRNA 表达水平的增加,包括碱性磷酸酶(ALP),骨桥蛋白(OPN)和骨钙蛋白(OC).生物信息学和荧光素酶报告分析表明,Smad9 是MM-MSC 中miR-203a-3p.1 的直接靶标. RT-qPCR 和WB 分析显示Smad9 和miR-203a-3p 之间呈负相关,smad9 的过表达显著增强了miR-203a-3p.1 抑制剂对成骨细胞标志物的作用,miR-203a-3p.1 抑制剂通过上调Smad9 调节MM-MSC 的成骨分化.还发现在miR-203a-3p.1 被抑制后Wnt3a/β-连环蛋白信号传导途径被激活.结论 MM-MSC 与N-MSC 存在差异性表达的circRNA、LncRNA、mRNA、micro RNA,miR-203a-3p.1 通过调节Smad9 表达在MM-MSC 的成骨分化中起重要作用,miR-221-5p 可通过上调smad3 调节MBD-MSCs的成骨分化.
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