【摘 要】
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分离纯化柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)扬州株的配子体,提取总RNA后用RT-PCR方法扩增出Etgam59基因.将目的片段与pGEM-T-Easy载体连接,常规方法转化感受态大肠杆菌DH5α,蓝白斑法筛选阳性克隆,经PCR和EcoR Ⅰ酶切鉴定后测序,用相关软件进行序列分析.结果显示,克隆的Etgam5基因全长为1617 bp,与E.tenella基因组序列中Etgam59进行比
【机 构】
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扬州大学,兽医学院,江苏,扬州 225009
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会
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分离纯化柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)扬州株的配子体,提取总RNA后用RT-PCR方法扩增出Etgam59基因.将目的片段与pGEM-T-Easy载体连接,常规方法转化感受态大肠杆菌DH5α,蓝白斑法筛选阳性克隆,经PCR和EcoR Ⅰ酶切鉴定后测序,用相关软件进行序列分析.结果显示,克隆的Etgam5基因全长为1617 bp,与E.tenella基因组序列中Etgam59进行比较,两者的同源性为99.9％；该基因编码538个氨基酸,经预测软件分析该蛋白存在一个酪氨酸和丝氨酸富集区,拥有13个抗原决定簇,在酪氨酸和丝氨酸富集区含有两个抗原表位.根据目的基因在去掉信号肽序列后以及表达载体pET-28a(+)的序列特点设计特异性引物,以构建的重组质粒pGEM-T-Easy-Etgam5为模板,经PCR扩增出大小为1569 bp的目的片段,并将其插入到载体pET-28a(+)上,构建成重组表达载体pET-28a(+)-Etgam59,将其转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经诱导后表达出分子量为61.2 kDa的可溶性蛋白(rEtGAM59)；经Western-blot检测,rEtGAM59蛋白能被抗6×HIS标签单抗和鼠抗rEtGAM59蛋白多抗所识别,也能被E.maxima、柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)和毒害艾美耳球虫(E.necatrix)的康复血清所识别,显示rEtGAM59蛋白具有抗原性.7周龄雏鸡逐只经口感染1×108个E.tenella扬州株孢子化卵囊.感染后96 h、108 h、120 h、132 h、144 h、156 h、168 h分别扑杀雏鸡,取盲肠组织制作石蜡组织切片,分别进行H.E.染色和免疫荧光组织化学染色.结果显示,荧光标记仅出现在大配子体的成壁体和卵囊壁,表明Etgam59基因确实为配子体蛋白基因,其表达产物主要存在于大配子体的成壁体,参与卵囊壁的形成.以雏鸡为试验动物,设计了2个试验,以死亡率、相对增重率、病变记分减少率与相对卵囊产量、细胞免疫和体液免疫水平等为指标,评价了重组蛋白rEtGAM59的免疫保护效果.结果显示：三个重组蛋白+佐剂免疫组的免疫保护力均低于卵囊免疫组(P＜0.05),但好于其他各免疫组(P＜0.05),其中以中剂量重组蛋白+佐剂组免疫效果最好；佐剂免疫组在增重、卵囊减少率等方面相同于重组蛋白免疫组,均接近未免疫攻虫组(P＞0.05).
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