【摘 要】
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基因修饰斑马鱼的建立为疾病模型构建、药物筛选、器官发育发生等研究提供了良好的实验动物基础。其中大量研究涉及多基因的共表达,在转基因动物制备中依赖内部核糖体结
【机 构】
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河北医科大学河北省实验动物重点实验室,石家庄050017
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基因修饰斑马鱼的建立为疾病模型构建、药物筛选、器官发育发生等研究提供了良好的实验动物基础。其中大量研究涉及多基因的共表达,在转基因动物制备中依赖内部核糖体结合位点(IRES)的载体构建策略以实现双顺反子及多顺反子表达的研究已有报道,但因IRES序列较大且序列前后基因表达量不一致等缺点而使应用受限。来源于病毒的可进行自我剪切的"2A"肽序列平均长度在18-22个氨基酸之间,在蛋白翻译时核糖体通过跳跃可从"2A"肽自身最后两个氨基酸C末端断裂,实现2A肽前后基因的共同且成比例地单独表达。为将此"2A"肽应用于双顺反子或多顺反子转基因斑马鱼的制备,本实验以Infusion法将GFP-2A-Cherry序列构建到Tol2质粒上,并将构建所得Tol-GFP-2ACherry质粒用于细胞转染与1-细胞期斑马鱼胚胎注射。通过荧光确认并追踪HeLa细胞、斑马鱼幼鱼及成鱼内GFP与cherry蛋白的共表达情况,通过qPCR法与western blot法验证GFP和Cherry蛋白的同时表达与剪切情况。结果表明,此种方法可成功获得共表达有GFP与cherry蛋白的瞬时转染HeLa细胞与转基因斑马鱼,GFP与cherry蛋白均可单独过表达且此种表达呈现时空一致性；且GFP-2A-cherry融合蛋白被剪切为GFP与cherry蛋白的剪切效率随着时间变化呈现1∶1成比例变化趋势。此项研究为今后在斑马鱼体内实现利用单一载体、单一启动子调控表达多基因的思路提供了实验依据与方法,并证明了多个基因在各自不影响蛋白功能的情况下均可实现斑马鱼体内的过量表达。
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