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目的：探讨小檗碱(Berberine,Berb)与硼替佐米(Bortizomib,Bort)联合在抑制骨髓瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡方面的作用及可能的机制.
方法：取培养至对数生长期的多发性骨髓瘤U266细胞株,分别加入Berb和Bort,通过四唑盐比色法(methylthiazolyl method MTT)检测Berb和Bort作用后对U266细胞株的增殖作用的影响,应用OriginPro7.5软件计算Berb和Bort作用于细胞系的IC50浓度,用金(正均)氏公式判断Berb和Bort的联合作用是否具有协同性;用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测两种药物单独及联合应用对MM细胞株U266凋亡的影响,用金(正均)氏公式判断Berb和Bort的联合作用对骨髓瘤细胞早期促凋亡作用是否具有协同性;同时应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测两种药物单独及联合应用后天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶-3,-8,-9(caspase-3,-8,-9)活性表达;行免疫印迹法(Western Blot)检测药物作用后凋亡通路中Fas-相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD),TNF受体相关死亡域蛋白(TNF-associated death domainprotein,TRADD)水平表达的变化.
结果：1.细胞形态学结果:倒置相差显微镜观察U266细胞株呈悬浮生长,致密细胞团样,折光性好,细胞明亮圆润,胞膜完整无破损,胞质透明无颗粒;碎裂细胞极少见;经20umol/L的Berb处理后24小时的细胞可见少量细胞坏死,丧失正常细胞形态,折光性消失;10nmol/L的Bort作用24小时后,可见一半以上细胞死亡,其正常细胞形态丧失,细胞皱缩变小,折光性消失,细胞裂解碎片多见;联合用药组所见绝大部分细胞死亡,正常形态丧失,折光性消失,细胞皱缩变形,裂解碎片多见.2.MTT结果:Berb对U266细胞株的增殖有较明显的抑制作用,随着作用剂量的增加及作用时间的延长,Berb对细胞增殖的抑制作用有所增加,呈剂量和时间依赖性.作用24小时的IC50值＞60umol/L,48小时的IC50值54.22umol/L;Bort对U266细胞株的增殖有明显的抑制作用,随着作用剂量的增加及作用时间的延长,其对细胞增殖的抑制作用明显增加.作用24小时的IC50值为11.8nmol/L,48小时的IC50值为6.2nmol/L,与以往文献报道相当;分别选择低于24小时及48小时IC50值浓度的Bort10nmol/L及5nmol/L与Berb不同浓度(10umol/L、20umol/L、30umol/L、40umol/L及60umol/L)联合用药,联合用药后对u266细胞株增殖的抑制作用较单药明显增强,差异具有统计学意义(P＜0.05),经金(正均)氏方程证实两药联合对骨髓瘤细胞株U266的增殖具有协同抑制作用.3.流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测两种药物单独及联合应用对MM细胞系凋亡的影响,结果显示U266细胞株对Berb及Bort均敏感.浓度为20umol/L的Berb和浓度为5nmol/L的Bort单药或联合作用6h和12h均可诱导细胞发生早期凋亡(PI阴性/Annexin V-FITC阳性象限代表早期凋亡细胞).根据金(正均)氏公式分析的结果:两药联合作用12h后,根据其早期凋亡率计算Q值为1.197,即两药联合的促凋亡具有协同作用.4.根据ELISA检测结果提示,单独应用Berb后caspase-8活性较对照组升高,而Bort组增加不明显;单独应用Bort后caspase-9活性较对照组增加,Berb组增加不明显;提示Berb可能通过激活caspase-8表达,活化的caspase-8可以剪切并活化caspase-3,活化的caspase-3可以剪切多聚聚合酶(ADP-核酶),引起DNA的降解使细胞凋亡.双药联合应用caspase-8,-9,-3活性水平表达均较前明显增加(P＜0.05).提示Berb及Bort单药及联合用药均可通过激活caspase系统促进骨髓瘤细胞株U266发生凋亡,但Berb与Bort促凋亡通路不同.5.Western Blot结果检测发现Berb单药20umol/L应用后24小时及48小时后,细胞裂解液中TRADD,FADD蛋白水平均较对照组增加(P＜0.5);Bort单药5nmol/L应用后24小时及48小时后,细胞裂解液中TRADD,FADD蛋白水平均较对照增加不明显(P＞0.05);联合用药后TRADD,FADD蛋白水平均较对照组明显增加(P＜0.01).
结论：(1)Berb对多发性骨髓瘤细胞株U266的增殖具有抑制作用;与Bort联合作用于U266细胞株时,对抑制U266细胞株增殖及诱导凋亡具有协同作用.(2)Berb联合Bort可协同促进骨髓瘤细胞凋亡,这种作用可能是通过与死亡受体相关配体结合,上调TRADD及FADD蛋白表达水平,进而激活caspase-3,caspase-8,caspase-9表达,产生一系列级联反应,诱导细胞凋亡.