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目的：对从中国湖北武汉蛇山的土壤中分离得到的小单孢菌菌株C-3509的发酵、分离纯化的抗生素C-3509B进行抗肿瘤活性及机制研究。
方法：通过ESI-MS、HR-ESI-MS以及1H-NMR分析等前期工作，已基本确定抗生素C-3509B为已知的烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicin 1I。MTT法测定抗生素C-3509B对人肝癌HepG2细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人直肠癌HCT116细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人肺癌A549细胞、人成纤维肉瘤HT1080细胞、人宫颈癌Hela细胞、人成骨肉瘤MG63细胞，人卵巢癌SKOV3细胞、人胃癌BGC823细胞以及口腔上皮癌KB细胞10种肿瘤细胞的增殖抑制作用；流式细胞术测定DNA损伤——磷酸化组蛋白H2A.X水平以及周期分布、DNA多倍体化及细胞凋亡率变化；琼脂糖凝胶电泳检测“DNA ladder”变化；Western blot检测周期调节蛋白Chk1、Chk2、p53、p21、p-cdc2和Cyclin B等及凋亡相关蛋白PARP、caspase3、caspase9等的表达。
结果：抗生素C-3509B对10种肿瘤细胞的IC50值为0.28-2.11 nmol·L-1，与文献报导的烯二炔类抗肿瘤抗生素的IC50值数量级相近，与文献报导的calicheamicin1I的IC50值基本一致。0.1nmol·L-1、0.5 nmol·L-1的抗生素C-3509B作用Hep G2细胞1h后其磷酸化组蛋白H2A．X水平分别比对照组增加35％、90％左右，表明抗生素C-3509B在短时间内损伤DNA。抗生素C-3509B在0.1～0.5 nmol·L-1的浓度范围内诱导G2／M期阻滞，0.1 nmol·L-1、0.5 nmol·L-1剂量下作用Hep G2细胞24 h后，其G2／M期的细胞分别为34.63％和83.17％，显著高于对照组G2／M期细胞10.96％；并且在该浓度范围内出现细胞裂亡的特征：细胞体积增大，出现多核化细胞，0.1 nmol·L-1、0.5 nmol·L-1的抗生素C-3509B作用Hep G2细胞24 h后，其DNA多倍体细胞分别达11.36％和19.75％，并具有一定的剂量依赖性和时间依赖性；Westernblot检测发现此时ATM／Chk2信号通路激活，p-Chk2、p53、p21剂量依赖性上调，p-cdc2表达上调，Cdc25A表达下降，Cyclin B／cdc2复合物活性下调。1 nmol·L-1及更高浓度的抗生素C-3509B则诱导细胞凋亡，此时周期阻滞及细胞多核化现象消失，1 nmol·L-1、2.5nmol·L-1和10 nmol·L-1的抗生素C-3509B处理Hep G2细胞24后其细胞凋亡率分别为11.80％、24.58％和82.22％，并出现DNA ladder，Western blot结果表明caspase-9、caspase-3活化，出现PARP的89kD切割片段。
结论：抗生素C-3509B是一种对多种肿瘤细胞具有强烈杀伤性的烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以开发为“弹头”药物与单抗及单抗片段等构建免疫偶联物用于肿瘤的靶向治疗。在较低浓度时抗生素C-3509B通过激活ATM／Chk2信号通路诱导G2／M期阻滞，同时出现细胞裂亡的特征，国内外均未见文献报导。
方法：通过ESI-MS、HR-ESI-MS以及1H-NMR分析等前期工作，已基本确定抗生素C-3509B为已知的烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicin 1I。MTT法测定抗生素C-3509B对人肝癌HepG2细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人直肠癌HCT116细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人肺癌A549细胞、人成纤维肉瘤HT1080细胞、人宫颈癌Hela细胞、人成骨肉瘤MG63细胞，人卵巢癌SKOV3细胞、人胃癌BGC823细胞以及口腔上皮癌KB细胞10种肿瘤细胞的增殖抑制作用；流式细胞术测定DNA损伤——磷酸化组蛋白H2A.X水平以及周期分布、DNA多倍体化及细胞凋亡率变化；琼脂糖凝胶电泳检测“DNA ladder”变化；Western blot检测周期调节蛋白Chk1、Chk2、p53、p21、p-cdc2和Cyclin B等及凋亡相关蛋白PARP、caspase3、caspase9等的表达。
结果：抗生素C-3509B对10种肿瘤细胞的IC50值为0.28-2.11 nmol·L-1，与文献报导的烯二炔类抗肿瘤抗生素的IC50值数量级相近，与文献报导的calicheamicin1I的IC50值基本一致。0.1nmol·L-1、0.5 nmol·L-1的抗生素C-3509B作用Hep G2细胞1h后其磷酸化组蛋白H2A．X水平分别比对照组增加35％、90％左右，表明抗生素C-3509B在短时间内损伤DNA。抗生素C-3509B在0.1～0.5 nmol·L-1的浓度范围内诱导G2／M期阻滞，0.1 nmol·L-1、0.5 nmol·L-1剂量下作用Hep G2细胞24 h后，其G2／M期的细胞分别为34.63％和83.17％，显著高于对照组G2／M期细胞10.96％；并且在该浓度范围内出现细胞裂亡的特征：细胞体积增大，出现多核化细胞，0.1 nmol·L-1、0.5 nmol·L-1的抗生素C-3509B作用Hep G2细胞24 h后，其DNA多倍体细胞分别达11.36％和19.75％，并具有一定的剂量依赖性和时间依赖性；Westernblot检测发现此时ATM／Chk2信号通路激活，p-Chk2、p53、p21剂量依赖性上调，p-cdc2表达上调，Cdc25A表达下降，Cyclin B／cdc2复合物活性下调。1 nmol·L-1及更高浓度的抗生素C-3509B则诱导细胞凋亡，此时周期阻滞及细胞多核化现象消失，1 nmol·L-1、2.5nmol·L-1和10 nmol·L-1的抗生素C-3509B处理Hep G2细胞24后其细胞凋亡率分别为11.80％、24.58％和82.22％，并出现DNA ladder，Western blot结果表明caspase-9、caspase-3活化，出现PARP的89kD切割片段。
结论：抗生素C-3509B是一种对多种肿瘤细胞具有强烈杀伤性的烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以开发为“弹头”药物与单抗及单抗片段等构建免疫偶联物用于肿瘤的靶向治疗。在较低浓度时抗生素C-3509B通过激活ATM／Chk2信号通路诱导G2／M期阻滞，同时出现细胞裂亡的特征，国内外均未见文献报导。