【摘 要】
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本研究建立一种简便、灵敏而又特异的环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification Method，RT-LAMP)用于H3亚型流感病毒的检测。根据GenBank中注册的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列，设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP反应体系，优化LAMP反应条件，等温扩增反应条件为65
【机 构】
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华南农业大学 动物科学学院，广东 广州 510642 中山大学 生命科学学院，广东 广州 5102
【出 处】
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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会
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本研究建立一种简便、灵敏而又特异的环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification Method，RT-LAMP)用于H3亚型流感病毒的检测。根据GenBank中注册的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列，设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP反应体系，优化LAMP反应条件，等温扩增反应条件为65℃保温60min。扩增后产物可用核酸染色剂SYBRⅠ进行鉴定，检测结果可视(阴性为橙黄色，阳性偏绿色)；同时用特异性内切酶KpaⅠ进行酶切鉴定。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品，检测结果与病毒分离、RT-PCR方法符合率均达到100％。RT-LAMP技术整个检测过程只需1h～2h，不需要PCR仪和成像系统，仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验，验证了建立RT-LAMP技术可以作为一种操作简单，灵敏性、特异性高的检测H3亚型猪流感病毒的技术。
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采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到IFN-γ基因，将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中。将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ，体外转染CEF细胞，24h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)检测，表达蛋白具有良好的免疫原性。然后利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水疱口炎病毒(VSV*GFP)在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活
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