【摘 要】
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竹黄菌主要寄生于箭竹属和短穗竹属竹子植物.可用于治疗虚寒胃病、风湿性关节炎、气管炎、百日咳、坐骨神经痛、跌打损伤及贫血头痛等病症.竹黄菌素主要从天然竹黄中提取,与
【机 构】
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江南大学生物工程学院,无锡214122
【出 处】
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华东六省一市生物化学与分子生物学会2015年学术交流会
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竹黄菌主要寄生于箭竹属和短穗竹属竹子植物.可用于治疗虚寒胃病、风湿性关节炎、气管炎、百日咳、坐骨神经痛、跌打损伤及贫血头痛等病症.竹黄菌素主要从天然竹黄中提取,与金丝桃素结构相似,许多学者对其比较研究表明,两者具有类似的作用机理,均是通过光照激活产生活性氧从而达到治的目的,在医领域具有抗肿瘤的功能和抗HIV、HSV等病毒的功能.因在竹黄菌Shiraia sp.SUPERH-168中缺乏有效的表达系统,使得该菌仍停留在发酵优化、纯化及其医药应用领域,然而其合成竹红菌素的代谢机理研究甚少.另一方面,随着高通量技术的快速发展,竹黄菌全基因组序列已测序,合成竹红菌素代谢基因簇也相应的被注释.因此,目前有必要在竹黄菌中建立有效表达系统,为解析竹红菌素代谢途径奠定分子基础.
本研究运用聚乙二醇/CaCl2转化技术，在竹黄菌SUPERH-168建立了含潮霉素与绿色荧光蛋白筛选标记的慢病毒表达系统。该过程主要包括原生质体制备、聚乙二醇/CaC12转化及阳性克隆子筛选。从酶种类、酶量、酶解温度、和渗透压稳渗剂及浓度等5个方面优化原生质体制备条件。结果表明:“81.25U/ml破壁酶+5mg/mL崩溃酶+5mg/mL葡聚糖酶”酶组合，抱子菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度30℃,酶液pH5.8、以0.6mol/L MgS04·7H2O为渗透压稳定剂制备原生质体最好，原生质体产率为5×106/g。表达质粒经聚乙二醇/CaCl2转化后，在含500μg/mL潮霉素PDA，挑选克隆子，荧光显微镜下，观测到较强的绿色荧光型号，野生菌SUPER-H168无此信号。
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