【摘 要】
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顺序酶电极是生物传感器的一大类群，其原理是利用数种相关酶，顺序、协调地催化一系列反应，完成单酶传感器难以进行的检测项目.据检索从1990年至2000年的世界生物传感学术大会的论文摘要，在目前已经报道的100多种生物传感器中，30％以上采用顺序酶传感器法.然而，与单酶传感器相比，顺序酶传感器普遍存在稳定性、互换性和灵敏度较差等问题.本研究以麦芽糖传感器为例，采用基因操纵，实现糖化酶(GA)和葡萄糖氧
【机 构】
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中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071 Biochemistry Department, I
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顺序酶电极是生物传感器的一大类群，其原理是利用数种相关酶，顺序、协调地催化一系列反应，完成单酶传感器难以进行的检测项目.据检索从1990年至2000年的世界生物传感学术大会的论文摘要，在目前已经报道的100多种生物传感器中，30％以上采用顺序酶传感器法.然而，与单酶传感器相比，顺序酶传感器普遍存在稳定性、互换性和灵敏度较差等问题.本研究以麦芽糖传感器为例，采用基因操纵，实现糖化酶(GA)和葡萄糖氧化酶(GOD)的融合，制备融合蛋白顺序酶麦芽糖传感器，建立了融合蛋白制备顺序酶传感器的模式方法.
通过基因水平的分子操纵，将黑曲霉GOD基因、连接肽(Ser-Gly)5编码序列和黑曲霉GA基因依次拼接，获得GOD-(Ser-Gly5)-GA(GLG)融合基因.将融合基因重组进大肠杆菌-酵母穿梭质粒pPIC9，实现其在甲基酶母巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)中的高效表达.融合蛋白GLG分子量高达410 kD，经QsepharoseTM Fast Flow 阴离子交换柱一步纯化就达电泳纯.动力学性质分析表明，GLG基本保持了GA和GOD的原有活力，且与酵母产生的GA和GOD具有相似的催化动力学特性.将GLG和相同活力的GA和GOD混合物(GA/GOD)同时固定在戊二醛修饰过的玻片上，GLG的顺序催化效率远远高于GA/GOD，体现了融合蛋白在固定化方面的优势.分别用GLG和GA/GOD制备麦芽糖传感器，并将两种传感器的性能进行了比较分析.结果表明，GLG可有效提高麦芽糖传感器的信号强度、线性范围及酶膜的互换性，使麦芽糖传感器的性能得到明显改善.
本研究将融合蛋白技术引入生物传感器的研究，成功地构建了具有双酶活力的融合蛋白，以实现顺序作用酶控制的共固定化，建立了融合蛋白技术制备顺序酶传感器的模式方法，为解决顺序酶传感器灵敏度和互换性差的难题提供了新的途径，同时也为解决其他顺序酶反应的低效率问题提供了一种新思路.
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