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目的：J亚群禽白血病病毒(ALV-J)利用Na+/H+交换1型跨膜细胞表面蛋白(NHE1)作为受体实现其感染.NHE1膜外环结构域与ALV-J的相互作用,是病毒进入细胞的关键环节.NHE1第一膜外环(Loop1)是跨膜蛋白NHE1最大膜外环,是ALV-J与chNHE1结合关键域.为了确定Loop1是ALV-J与chNHE1相结合的关键域,以及Loop1抗体是否能够阻断ALV-J的感染,制备Loop1抗体,并且通过细胞毒性检测,免疫组织化学和荧光定量PCR方法检测Loop1抗体对AVL-J感染的影响.
方法：目的基因克隆测序：以chNHE1Loop1基因序列为目的基因设计引物，序列如下：上游5’-ATATATGAATTCGCCGACGCCACGCGTGTCT-3’下游5’-GAGCGAGATCTCGAAGGGGAGCGGCCGCATATAT-3’，以SPF鸡肾脏提取RNA转录为cDNA为模板，扩增获得全基因，连接转化阳性重组质粒测；构建表达载体：提取测序正确质粒转化到pGEX-6P-1表达载体中，大量表达蛋白，通过Blab/C小鼠制备chNHE1（Loop1）抗体；免疫组织化学检测：将确诊为ALV-J感染的120日龄海兰褐蛋鸡和同日龄SPF海兰褐蛋鸡同时做免疫组织化学检测，通过光学显微镜观察chNHE1在ALV-J在感染鸡和未感染鸡的差异；细胞毒性检测：用CCK-8试剂确定最适抗体工作浓度为100μg/ml；荧光定量PCR检测：将100μg/ml浓度Loop1抗体和ALV-J接种103TCID50100μL ALV-J同时接种CEF细胞，分别培养不同时间点，搜集细胞提取RNA，逆转录，进行相对荧光定量PCR检测病毒mRNA。
结果：1、免疫组织化学结果显示，观察到ALV-J感染鸡组化切片chNHE1表达量明显增高，证明在ALV-J可诱导chNHE1的表达。2、荧光定量PCR结果显示，Loop1抗体病毒联合作用组ALV-J基因表达量比病毒组表达量降低了2.1倍，而ALV-J的RNA水平降低了53％，对ALV-J感染具有明显的阻断作用，说明Loop1是病毒进入细胞的重要结合域。
结论：本实验通过Loop1抗体的制备，将anti-Loop1抗体与ALV-J同时接种CEF细胞，通过荧光定量PCR检测，接种anti-Loop1抗体可以有效的抑制ALV-J在细胞内转录与合成，因此证明了anti-Loop1可以有效阻断ALV-J病毒感染，其为ALV-J免疫抑制和致瘤机制的研究奠定了基础。