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目的 猪是人类异种器官移植的理想供体.然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白(signal regulatory protein α,SIRPα)不能识别异种细胞表面的整合素相关蛋白CD47,导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除.目的 本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入人CD47(hCD47)基因,创建GTKO/hCD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬.GTKO/hCD47猪的骨髓可用于诱导免疫耐受,减弱移植受体对异种供体组织或器官的排斥反应.方法 构建广泛性表达启动子(CAG)调控表达hCD47基因的载体pCAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,筛选出阳性细胞克隆,通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪.利用PCR对克隆仔猪进行鉴定,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)及免疫组化分析hCD47在转基因猪各组织中的表达.分离转基因猪的外周血单核细胞PBMC并使用CFSE标记,通过流式细胞术检测猪PBMC与人巨噬细胞体外共孵育后的剩余率,以检测hCD47基因在抗巨噬细胞吞噬中的效果.GTKO/hCD47猪性成熟后进行配种繁育,扩繁F1代转基因猪.结果 通过体细胞核移植获得重构胚,移植647枚胚胎到4头受体母猪.4头受体均妊娠至终期产仔13头,PCR鉴定显示13头仔猪均为阳性.qRT-PCR结果显示hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、肾脏和心脏.免疫组化证实hCD47基因在各组织中都有蛋白表达.通过流式细胞术检测转hCD47基因猪PBMC中hCD47的表达,结果显示PBMC明显表达hCD47.THP-1来源的人巨噬细胞与猪PBMC细胞体外共孵育,结果显示表达hCD47基因的猪PBMC细胞在THP-1来源的人巨噬细胞中的存活率显著高于不表达hCD47基因的猪PBMC细胞(p＜0.05).2头GTKO/hCD47母猪与GTKO公猪配种后产下11头活的仔猪,其中5头为hCD47阳性猪.结论 本研究在国内首次成功建立了表达hCD47的GTKO巴马小型猪,明确了hCD47在主要组织和细胞中的表达,初步验证了hCD47具有抗人巨噬细胞吞噬的作用.GTKO/hCD47猪繁育正常,遗传稳定,获得F1代GTKO/hCD47猪.