【摘 要】
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以原代肝细胞为种子细胞的模型体系在人工肝的体外构建研究中倍受关注。但其在体外单层培养中易于出现"去分化",即代谢酶系和转运蛋白表达及功能活性的丧失。因此,如何克
【机 构】
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大连医科大学基础医学院组织胚胎学教研室,大连116044
【出 处】
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第十一届全国再生医学(干细胞与组织工程)学术研讨会暨第七届全国组织工程与再生医学大会
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以原代肝细胞为种子细胞的模型体系在人工肝的体外构建研究中倍受关注。但其在体外单层培养中易于出现"去分化",即代谢酶系和转运蛋白表达及功能活性的丧失。因此,如何克服或延缓肝细胞的"去分化"并阐明其具体作用机制是微型人工肝研究中所亟待解决的关键。本研究采用体外三维共培养技术,以多孔丝蛋白为支架,在混合细胞外基质组分的基础上,通过接种大鼠原代肝细胞与肝星形细胞,体外构建了可部分模拟肝细胞微环境的肝细胞三维共培养体系。我们采用光学显微镜,Live/dead染色,H&E染色以及SEM检测对该模型进行形态学观察及表型评价；采用免疫荧光染色,qRT-PCR,ELISA以及HPLC分析等技术对肝细胞的功能蛋白表达,关键转录因子及代谢酶的基因表达,白蛋白与尿素的合成能力以及关键代谢酶的活性等进行功能学评价。实验结果表明：原代肝细胞在三维培养体系下可保持理想的活性,且与基质细胞紧密结合形成大量细胞团。对比平面单一培养体系,三维共培养条件下的肝细胞白蛋白分泌以及尿素合成的功能显著提高；且关键转录因子及代谢酶基因的转录表达水平可提高10-25倍。此外,肝细胞色素P450酶的代谢活性在整个体外培养过程中呈现时间依赖性降低：其中该活性改变在平面培养条件下尤为显著：48h后其代谢活性几乎完全消失；而三维共培养条件下,该酶系的活性显著高于平面培养,在培养12天后,仍可通过HPLC检测到相关代谢酶的代谢产物。这表明该三维共培养体系可部分维持原代肝细胞在体外培养过程中的表型与功能,从而延缓原代肝细胞"去分化"。综上,本研究工作成功构建了原代肝细胞-基质细胞三维共培养模型。
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