【摘 要】
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本试验应用RT-PCR方法,从鹅的脾脏、骨髓和法氏囊等组织器官中扩增到3个新的鹅AvBDs基因.将其推导的氨基酸序列与其他β-防御素序列分析比较,结果显示这3个AvBDs基因分别为鹅β-防御素1(AvBD1)、鹅β-防御素3(AvBD3)和鹅β-防御素6(AvBD6).经核苷酸序列测定分析结果表明,鹅AvBD1cDNA由198个碱基组成,编码65个氨基酸残基；鹅AvBD3 cDNA由182个碱基组
【机 构】
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东北农业大学动物营养研究所,哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室,哈尔滨150001
【出 处】
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中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会
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本试验应用RT-PCR方法,从鹅的脾脏、骨髓和法氏囊等组织器官中扩增到3个新的鹅AvBDs基因.将其推导的氨基酸序列与其他β-防御素序列分析比较,结果显示这3个AvBDs基因分别为鹅β-防御素1(AvBD1)、鹅β-防御素3(AvBD3)和鹅β-防御素6(AvBD6).经核苷酸序列测定分析结果表明,鹅AvBD1cDNA由198个碱基组成,编码65个氨基酸残基；鹅AvBD3 cDNA由182个碱基组成,编码60个氨基酸；鹅AvBD6 cDNA由204个碱基组成,编码67个氨基酸残基.鹅AvBD3和鹅AvBD6与对应的鸡AvBD3和鸡AvBD6基因的同源性为100％,鹅AvBD1与鸵鸟AvBD1基因的同源性最高,为70.7％.将鹅AvBD1、3、6基因分别亚克隆到表达载pGEX-6p-1上,构建3个重组表达质粒pGEX-GooseAvBD1、3、6将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,后进行蛋白纯化.SDS-PAGE电泳表明,3种重组蛋白分子量为31 ～ 32kDa,3个重组菌的表达产物均以包涵体的形式存在.同时,根据这3个多肽的成熟序列,分别合成3个合成多肽(sAvBD1、3、6).选用4株革兰氏阳性菌(四联球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌)和8株革兰氏阴性菌(奇异变形杆菌、绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、兔波氏杆菌)做为检测菌,利用菌落计数法测定抗菌活性,结果显示标签蛋白GST对各种细菌没有抑制作用；重组和合成蛋白对所测的12株细菌均具有不同程度的抑菌活性.本试验还以多杀性巴氏杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)作为试验菌,测定不同盐浓度对重组蛋白以及合成蛋白的影响,结果显示,随 着盐浓度的增加,其抗菌活性明显减弱,而在高盐浓度条件下,该重组蛋白仍具有抗菌活性.另外,对该重组、合成鹅AvBD1、3、6蛋白进行了溶血活性的试验,发现鹅AvBDs溶血活性极低,与阴性对照相比,无显著差异(P＞0.05).为探讨这3个鹅AvBDs的抗感染机制,本试验采用肠炎沙门氏菌人工感染15日龄东北籽鹅,分别于感染后6h、24h、48h、72h采取鹅部分组织样品,主要是免疫组织和肠组织,并用荧光定量PCR方法检测这3个基因,部分炎性细胞因子,及其鹅Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)4的表达量.结果表明,受感染后,这3个AvBD基因在不同组织中的表达量变化较大,其中AvBD1基因在骨髓中的表达量显著提高,AvBD3基因在骨髓、脾和大肠中的表达量显著提高,AvBD6基因在免疫组织中的表达量都显著提高.以上结果说明了鹅AvBDs具有可诱导性.同时发现,TLR4,以及鹅白细胞介素(IL)-2,IL-18,γ干扰素(IFN-γ)基因的表达量也相应提高.本研究结果初步表明,受肠炎沙门氏菌感染后,鹅机体可能通过TLR4激活细胞信号转导途径,提供刺激分子,诱导由T细胞分化产生的两种鹅细胞因子(IL-2和IL-18)以及鹅干扰素基因(IFN-γ)和3种鹅AvBDs基因的表达,激活天然免疫反应,协同建立机体获得性免疫防御,共同抵御肠炎沙门氏菌对鹅机体的攻击.
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