【摘 要】
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目的：多药耐药现象(multidrug resistance,MDR)是导致肝癌等原发性恶性肿瘤化疗失败的重要因素.其中,药物外排转运体P-gp(P-glycoprotein,由ABCB1(ATP-binding cassette,sub-family B(MDR/TAP),member1B)基因编码)的异常表达是造成MDR的主要原因之一,严重影响肝癌的化疗疗效.目前针对P-gp开发的小分子抑制剂
【机 构】
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中国科学院上海药物研究所 药物安全评价研究中心,上海201210
【出 处】
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2017年中国药学大会暨第十七届中国药师周
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目的：多药耐药现象(multidrug resistance,MDR)是导致肝癌等原发性恶性肿瘤化疗失败的重要因素.其中,药物外排转运体P-gp(P-glycoprotein,由ABCB1(ATP-binding cassette,sub-family B(MDR/TAP),member1B)基因编码)的异常表达是造成MDR的主要原因之一,严重影响肝癌的化疗疗效.目前针对P-gp开发的小分子抑制剂,绝大部分在临床应用上因毒性等问题均以失败告终.因此如何安全有效的抑制P-gp并成功攻克MDR成为目前亟需解决的问题.MicroRNAs(miRNAs)作为一类内源性的具有调节作用的小RNA分子,它对基因的表达除了经典的调控模式,即通过与靶基因mRNA的3-非编码区(3-UTR)配对来诱导蛋白编码基因的翻译抑制;还可以同时以直接或间接的方式对基因的转录水平发挥激活或抑制作用.这种miRNA的双重调控机制将进一步加强其自身对基因的调节作用.鉴于此,本研究主要是围绕miRNAs在P-gp介导的肝癌MDR中的重要作用所展开,并着重探讨了miRNAs对基因的双重调控作用在此领域的应用.
方法：首先结合生物信息学、Western Blot、RT-PCR、luciferase报告基因检测和CRISPR-CAS9介导的基因编辑技术等方法发现并验证了具有调节P-gp蛋白水平活性的miR-491-3p;接下来,基于同样的技术方法,发现了该miRNA的另一个直接作用靶点,即ABCB1上游转录因子Sp3.最后,采用流式细胞术和CCK8检测等方法,研究了miR-491-3p介导的药物增敏作用.
结果：在miR-491-3p的机制研究中发现：1)miR-491-3p可直接靶向Hep3B细胞中ABCB13UTR,在转录后水平抑制ABCB1表达;2)miR-491-3p同时直接靶向ABCB1上游转录因子Sp33UTR,进而在转录水平抑制ABCB1的表达.3)肝细胞系和肝癌临床样本分析均显示ABCB1,Sp3和miR-491-3p的表达水平呈现负相关.在miR-491-3p的功能研究中发现：1)流式检测发现miR-491-3p能增加细胞内药物蓄积,从而增强Hep3B细胞对化疗药物盐酸阿霉素(DOX)和硫酸长春花碱(VBL)的敏感性;2)无论是外源转入miR-491-3p抑制剂还是采用CRISPR/Cas9技术敲除内源miR-491-3p,均导致SMCC-7721,Bel-7402,Hep3B细胞内药物蓄积减少.3)过表达ABCB1或Sp3均能逆转Hep3B细胞中miR-491-3p介导的药物增敏作用.
结论：miR-491-3p可直接靶向ABCB1及其上游转录因子Sp3,同时在转录和转录后水平调节ABCB1表达,进而增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性.本研究不仅首次发现了miR-491-3p/Sp3/ABCB1调节轴在肝癌多药耐药中的双重调控作用,也为miR-491-3p的可能的临床应用奠定了理论基础.
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