【摘 要】
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目的 建立以α-突触核蛋白损伤的帕金森病细胞模型,为创新药物筛选提供模型基础.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)方法扩增表达人源α-突触核蛋白的目的基因,构建原核表达载
【机 构】
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天然药物活性物质与功能国家重点实验室,中国医学科学院神经科学中心,中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所,北京 100050
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目的 建立以α-突触核蛋白损伤的帕金森病细胞模型,为创新药物筛选提供模型基础.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)方法扩增表达人源α-突触核蛋白的目的基因,构建原核表达载体.将载体转化至大肠杆菌内,诱导其表达重组α-突触核蛋白.通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并通过蛋白免疫印迹和质谱技术进行鉴定.将得到的α-突触核蛋白以不同浓度作用于PC12细胞以及原代神经元,MTT法检测细胞存活率,以确定α-突触核蛋白的合适造模浓度.结果 PCR扩增获得的目的基因片段经凝胶电泳分离后显示与理论分子量大小一致,并成功嵌入至载体pET30a中；测序正确的融合载体成功转化至大肠杆菌E.Coli.BL21(DE3).通过改变温度、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、宿主菌的增殖状态以及诱导时间等条件,获得高表达目的蛋白表达的实验条件；通过亲和层析方法获得纯化的α-突触核蛋白,纯化蛋白的通过蛋白免疫印迹证明为α-突触核蛋白,质谱结果其分子质量为与目的蛋白理论分子质量基本一致.纯化的α-突触核蛋白刺激PC12细胞及原代神经元细胞后,细胞存活率明显下降,并且存活率的降低程度与α-突触核蛋白刺激浓度呈正相关.结论成功构建了α-突触核蛋白损伤的帕金森病细胞模型,可用于筛选具有抗帕金森病功能的创新化合物.
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