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目的:体外培养猪冠状动脉内皮细胞(porine coronary arteriesendothelialcell,PCAEC),建立缺氧再给氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,观察H/R及抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸脂(Pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)对PCAEC形态及丙二醛(malo naldehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)等含量的影响,观察H/R及PDTC对PCAEC核因子-κB P65(nuclear factor kappa-B,NF-κB P65)活性及细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的影响,观察H/R及PDTC对PCAEC细胞活力、细胞凋亡率的影响,探讨PCAEC缺氧再给氧损伤的发生机制及PDTC对该病理生理过程的影响。
方法:1.取猪冠状动脉,分离脂肪及结缔组织,采用酶消化法分离细胞作原代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态及DiI-Ac-LDL染色鉴定细胞。取第3-5代PCAEC用于实验。2.将PCAECs分为三组,对照组:未经处理。 H/R组:将细胞放置低氧环境(95％N2,5％CO2)37℃培养2h,再恢复正常环境(21％O2,74％N2,5％CO2)37℃培养。PDTC组:以100umol/L的PDTC与PCAEC共同孵育1h,再制作H/R模型。3.倒置相差显微镜观察各组PCAEC形态学变化,应用二硫代硝基苯甲酸比色法及硫代巴比妥酸比色法分別测定PCAEC缺氧2h、再给氧3h时MDA及GSH等物质含量,应用免疫细胞化学方法测定各组细胞缺氧2h、再给氧3h、再给氧15h时NF-κB P65及ICAM-1的表达,MTT比色法检测缺氧2h、再给氧3h时PCAEC活性,流式细胞术检测缺氧2h、再给氧3h时细胞凋亡率。
结果：
1.倒置相差显微镜下PCAEC单层贴壁生长,呈典型的铺路石样结构,细胞间连接紧密;DiI-Ac-LDL染色,在荧光显微镜下显示特征性的黄绿色荧光,细胞纯度大于98％。
2.细胞形态观察。对照组PCAEC呈单层铺路石样生长,细胞间连接紧密,在两个时间点细胞形态无明显改变。H/R组缺氧2h,部分细胞变圆收缩,细胞间隙增宽,再给氧3h大部分细胞变圆收缩,细胞间隙明显增宽,部分细胞脱落。PDTC组缺氧2h,大部分细胞贴壁生长,但细胞间隙较宽,少部分细胞变圆收缩,再给氧3h较缺氧2h细胞形态无明显改变,但个別细胞脱落。提示:缺氧改变PCAEC的正常形态,再给氧可使细胞更严重的变形,甚至使细胞脱落、死亡;PDTC可减轻上述改变。
3.MDA及GSH的含量。缺氧2h和再给氧3h时H/R组及PDTC组MDA含量较对照组同期明显升高(P＜0.05),其中PDTC组明显低于H/R组同期(P＜0.05);H/R组及PDTC组组内比较再给氧3h时MDA含量明显高于缺氧2h(P＜0.05),而对照组两时间点MDA含量比较无明显变化(P＞0.1)。缺氧2h和再给氧3h时H/R组及PDTC组GSH含量明显低于对照组同期(P＜0.05),其中PDTC组明显高于H/R组同期(P＜0.05),H/R组及PDTC组组内比较再给氧3h时GSH含量明显低于缺氧2h(P＜0.05),而对照组两时间点GSH含量比较无明显变化(P＞0.1)。提示:缺氧使PCAEC的氧自由基清除功能减退,再给氧进一步加重此种损害;PDTC可减轻缺氧再给氧引起的损害。
4.NF-κB P65及ICAM-1的表达。在三个时间点,对照组中NF-κBP65有一定程度的表达,H/R组及PDTC组NF-κB P65在缺氧2h表达明显增强,再给氧3h表达达峰值,以后逐渐回落,但阳性细胞率仍明显高于对照组同期(P＜0.05),其中PDTC组阳性细胞率明显低于H/R组同期(P＜0.05),H/R组及PDTC组组内比较再给氧3h、15h明显高于缺氧2h(P＜0.05),而对照组各时间点比较无明显变化(P＞0.1)。在三个时间点对照组中ICAM-1持续低强度表达,H/R组及PDTC组在缺氧2h时ICAM-1表达开始增强、再给氧3h表达明显增强,15小时达峰值,其表达强度明显高于对照组同期(P＜0.05),其中PDTC组ICAM-1表达程度明显低于H/R组同期(P＜0.05),H/R组及PDTC组组内比较再给氧15 h明显高于缺氧2h(P＜0.05),而对照组两时间点比较无明显变化(P＞0.1)。提示:缺氧再给氧使NF-κB、ICAM-1表达明显增加,而NF-κB活性明显增强与ICAM-1表达明显增多可能是内皮细胞损伤的重要因素)PDTC可有效地抑制NF-κB、ICAM-1表达,减轻缺氧再给氧引起的损害。
5.MTT测定 H/R组及PDTC组在缺氧2h,再给氧3h细胞活性明显低于对照组同期(P＜0.05),其中PDTC组细胞活性明显高于H/R组(P＜0.05)。H/R组及PDTC组组内比较再给氧3h明显低于缺氧2h(P＜0.05),而对照组两时间点细胞活性比较无明显变化(P＞0.1)。提示:缺氧损害PCAEC活性,再给氧可加重细胞活性的损害)PDTC可特异性抑制NF-κB及ICAM-1表达,减轻缺氧再给氧引起的细胞损害。
6.细胞凋亡检测 H/R组及PDTC组在缺氧2h、再给氧3h细胞凋亡率明显高于对照组同期(P＜0.05),其中PDTC组细胞凋亡率明显低于H/R组同期(P＜0.05),H/R组及PDTC组组内比较再给氧3h细胞凋亡率明显高于缺氧2h(P＜0.05),而对照组两时间点细胞凋亡率比较无明显变化(P＞0.1)。提示:缺氧可诱导PCAEC凋亡,再给氧可使细胞凋亡率进一步增加;PDTC通过特异性抑制NF-κB及ICAM-1表达,可降低缺氧再给氧引起的细胞凋亡。
结论:1.缺氧损害PCAEC的正常形态,再给氧可使细胞产生更严重变形,2.缺氧使PCAEC的氧自由基清除功能减退,再给氧进一步加重此种损害,3.H/R使NF-κB、ICAM-1表达明显增加,而NF-kB活性明显增强与ICAM-1表达明显增多可能是内皮细胞损伤的重要因素;4.缺氧可诱导PCAEC凋亡,再给氧可使细胞凋亡串进一步增加;5.PDTC能有效降低NF-κB活性及ICAM-1表达,减轻PCAEC缺氧再给氧损伤。