【摘 要】
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目的：探索简便高效富集人角膜缘上皮祖细胞的方法,为体外构建角膜缘上皮片提供充足的种子细胞.方法：无血清培养条件下,采用组织块培养法进行人角膜缘上皮祖细胞的体外扩充
【出 处】
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第十二届全国角膜及眼表疾病学术大会暨第四届全国角膜屈光手术大会
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目的：探索简便高效富集人角膜缘上皮祖细胞的方法,为体外构建角膜缘上皮片提供充足的种子细胞.方法：无血清培养条件下,采用组织块培养法进行人角膜缘上皮祖细胞的体外扩充培养；当细胞融合达90％时,使用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化,DTI(Defined Trypsin Inhibitor)终止消化,离心收集细胞,制成细胞悬液；依次使用孔径40μ m和30μm细胞滤网收集细胞直径小于30μm的细胞,按照5×104/cm2的细胞密度接种于包被Ⅳ型胶原蛋白的六孔板中,依据各个孔中所设细胞贴壁时间不同,共分5个时段,分别贴壁5mins、10mins、 20mins、 40mins、 60mins后,吸出未贴壁的细胞,置于37℃,5％CO2培养箱中过夜培养.采用免疫荧光染色技术检测5个时段贴壁细胞K3、p63蛋白的表达,并计算阳性细胞比例.结果：采用40μn和30μm细胞滤网可有效收集直径小于30μm的细胞,收集到的小体积细胞约占细胞总数的66.67％；5个时段的贴壁细胞表达K3的阳性细胞比例在贴壁60mins的细胞孔中最高,在贴壁5mins的细胞孔中最低,表达p63的阳性细胞比例在贴壁60mins的细胞孔中最低,在贴壁10mins的细胞孔中最高,比例为81.29％±0.05％,此时分离到的角膜缘上皮祖细胞阳性比例最高.结论：采用不同孔径滤网滤过和Ⅳ型胶原蛋白粘附相结合的方法,可以有效富集人角膜缘上皮祖细胞,为体外构建角膜缘上皮片提供充足的种子细胞.
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