【摘 要】
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目的 本实验旨在构建禽流感病毒聚合酶酸性亚基(PA)转基因小鼠,以期获得转基因小鼠模型,为流感病毒致病机理研究和抗流感药物开发提供新思路.方法 甲型H1N1流感病毒野毒株A/Changchun/01/2009(H1N1)为军事兽医研究所动物病毒学与特种疫病学实验室分离、保存,经RNA抽提逆转后从中扩增出甲型流感病毒H1N1PA基因的CDS基因全长序列.通过定向克隆的方法将其连接到pIRES2-GF
【机 构】
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河北省实验动物重点实验室,河北医科大学实验动物学部;北京协和医学院比较医学中心,中国医学科学院医学实验动物研究所;中国人民解放军军事兽医研究所动物病毒学研究室
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目的 本实验旨在构建禽流感病毒聚合酶酸性亚基(PA)转基因小鼠,以期获得转基因小鼠模型,为流感病毒致病机理研究和抗流感药物开发提供新思路.方法 甲型H1N1流感病毒野毒株A/Changchun/01/2009(H1N1)为军事兽医研究所动物病毒学与特种疫病学实验室分离、保存,经RNA抽提逆转后从中扩增出甲型流感病毒H1N1PA基因的CDS基因全长序列.通过定向克隆的方法将其连接到pIRES2-GFP载体上,酶切鉴定并测序.为提高目的基因表达效率再将重组质粒中的CMV启动子替换为UBC启动子,命名为pUBC-IRES-PA.转染至293T细胞,通过GFP表达情况检测其在细胞内的表达效率.Qiagen@EndoFree Plasmid Maxi Kit制备质粒,线性化后用SephadexG-50进行凝胶层析纯化,纯化产物用0.1×TE缓冲液稀释至终浓度5ng/μl.水平显微注射法将其导入140枚C57BL/6×B6D2F1受精卵原核.将注射后存活的约110枚受精卵移植入3只当日见栓的假孕KM雌鼠输卵管中.仔鼠出生10天后,提取尾尖组织DNA,PCR扩增鉴定仔鼠基因型.结果 构建的真核重组表达质粒pUBC-IRES-PA转染293T细胞后,可检测到PA的转录和表达.共产生14只子代小鼠,鼠尾PCR检测获得转基因阳性首建鼠1只,可以稳定遗传并建系.结论 本实验成功构建了pUBC-IRES-PA真核表达载体,初步获得了稳定整合PA基因的转基因小鼠,进一步进行基因表达情况与病理学方法检测后有望建立小鼠流感病毒PA蛋白转基因模型,促进流感发病机理研究和药物开发.
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