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目的：在各国药典和药品标准中,反相离子对色谱法用于核苷酸类药物如单磷酸阿糖腺苷、环磷腺苷、阿德福韦、西德福韦等药物的定性、定量分析,但无法与质谱兼容直接进行定性分析,限制其未知杂质的鉴定工作,且一直未能找到合适的以挥发性缓冲盐组成的液相流动相系统对这些杂质进行完全分离.本文以抗病毒药单磷酸阿糖腺苷为例,利用柱切换液相色谱-质谱联用在线除盐技术鉴定单磷酸阿糖腺苷中的杂质,解决以上问题.方法：第一维采用质谱不兼容的非挥发性流动相和离子对试剂10 mM四丁基氢氧化铵-10mM磷酸二氢钾(pH 4.3)–甲醇(40：40：20,v/v/v),反相C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)分离,流速1mL/min,检测波长260nm；第二维采用特殊的季铵盐类农药专用柱Acclaim Trinity Q1 column(2.1 mm×50mm,3μm)分离,挥发性流动相乙酸铵(100 mM,pH 5)–乙腈(20：80,v/v),流速0.4mL/min.将一维色谱中各杂质峰切换入第二维进行在线脱盐,将磷酸盐和离子对试剂与目标杂质分离后除去,再进入质谱分析,正负离子同时扫描测定.结果：在不改变单磷酸阿糖腺苷国家药品质量标准分析方法的前提下,通过柱切换液相色谱-线性离子阱质谱联用在线除盐技术使得分析条件能够兼容质谱并鉴定出单磷酸阿糖腺苷中的6种杂质,包括合成反应原料、中间产物、二磷酸化产物、二聚物、氧化产物和环磷酸化等产物.通过多级质谱鉴定未知杂质的结构并区分可能的异构体,并探讨杂质的质谱裂解规律,结合制备色谱得到的杂质进行核磁共振(NMR)分析,对未知杂质的结构及其同分异构体分析结果进行进一步确证.同传统的液相色谱-质谱中所用的氨基柱或HILIC柱相比,该方法使鉴定出杂质的数量明显提高,避免过量主成分产生的拖尾现象影响其他杂质的检出.结论：该方法巧妙地解决了液相条件和质谱不兼容的难题,值得推广应用.特别是能够为制药企业实际生产中的核苷酸类药物质量控制和工艺改进提供指导,无须改变原有色谱条件而使各目标杂质峰得到鉴定.