【摘 要】
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目的 前期相关研究表明结核分枝杆菌(M.tb) RV2347基因具有较好的特异性,本研究将构建其原核表达载体并获得其重组蛋白,并研究其抗原性,探讨其作为新型结核病特异性标志物的可行性.方法 用PCR方法扩增M.tb RV2347基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+)：RV2347重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导RV2347
【机 构】
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首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所 101149
【出 处】
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中华医学会结核病学分会2014年学术大会
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目的 前期相关研究表明结核分枝杆菌(M.tb) RV2347基因具有较好的特异性,本研究将构建其原核表达载体并获得其重组蛋白,并研究其抗原性,探讨其作为新型结核病特异性标志物的可行性.方法 用PCR方法扩增M.tb RV2347基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+)：RV2347重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导RV2347蛋白表达,经Ni+-NTA层析柱纯化获得重组蛋白.应用免疫印迹方法(Western Blot)同时检测结核病病人和PPD阴性正常人血清中该抗原基因对应的抗体.将纯化的RV2347重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗RV2347抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),将该兔抗血清进一步纯化获得其多克隆抗体；采用Western blot方法鉴定该多克隆抗体与重组蛋白RV2347的免疫反应性,并检测该多克隆抗体的特异性.结果 经酶切鉴定和测序分析证实RV2347原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带.用重组蛋白RV2347免疫接种新西兰大白兔后可诱导出高滴度的特异性抗体.纯化的重组蛋白RV2347被证实有较强的免疫原性；并制备了其多克隆抗体.结论 成功构建了原核表达重组质粒pET30a(+)：RV2347,并获得了其重组蛋白,对该蛋白的抗原性分析提示rv2347蛋白既有较好的免疫反应性也有很好的免疫原性.这为进一步研究其作为结核病的潜在分子标志物的可行性奠定了基础.
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