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目的:骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是治疗肝损伤最具临床应用前景的成体干细胞之一,但目前对肝组织微环境调控BMMSCs经肝向分化参与肝组织再生的过程尚不清楚.本研究通过制备不同浓度的肝脏细胞外基质(L-ECM)凝胶对BMMSCs进行三维培养,初步探讨L-ECM对BMMSCs肝向分化的促进作用和调控机制.
方法:采用去垢剂灌注法获得小型猪脱细胞肝脏基质,经低温研磨和均质化作用获得L-ECM凝胶,并与Ⅰ型胶原按0％、25％、50％、75％和100％混合.将P3代BMMSCs以1×104/ml的密度与上述凝胶混匀后三维培养,2w后对其中细胞进行观察,检测培养液中白蛋白和尿素的含量,确定细胞的功能;提取RNA和总蛋白检测肝实质细胞/胆管内皮细胞特异性分子marker表达;通过PAS染色和ALB免疫荧光检测三维培养体系中成熟肝细胞的形成,探讨L-ECM作为组织微环境对BMMSCs肝向分化的促进作用.
结果:BMMSCs在各浓度L-ECM凝胶中生长良好;L-ECM各组培养液中白蛋白含量和尿素含量较胶原组均有显著上升，且白蛋白含量随培养时间不断增加;早期肝向分化基因HNF6，肝实质功能基因ALB,CYP1A1，胆管内皮细胞基因CFTR, CK-19的表达均随L-ECM浓度的增加而上升，并于50%L-ECM组达到峰值，之后随L-ECM浓度增加逐渐下降;组织切片经PAS染色后发现，L-ECM凝胶中BMMSCs呈阳性，说明其具备一定的糖原合成能力;组织切片的ALB免疫荧光显示，L-ECM中约70%的BMMSCs表达ALB，而胶原组未见阳性细胞。
结论:L-ECM凝胶材料可诱导BMMSCs肝向分化，且该诱导作用呈一定的剂量依赖性关系。