【摘 要】
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根据GenBank登录的PRRSV基因序列,利用PRRSV非缺失变异株与缺失变异株NSP2基因序列特点,设计合成两对特异性引物,经RT-PCR扩增后,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,并
【基金项目】
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基金项目:国家生猪现代农业生产技术体系;广东省自然科学基金(5006678);广东省科技计划项目“高致病性蓝耳病综合防治技术的研究”(2007A0203006)。
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根据GenBank登录的PRRSV基因序列,利用PRRSV非缺失变异株与缺失变异株NSP2基因序列特点,设计合成两对特异性引物,经RT-PCR扩增后,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH-5a株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV缺失变异株与非缺失变异株的阳性重组质粒。以重组标准质粒作为模板,建立SYBR Green实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)用以鉴别诊断PRRSV缺失变异株与非缺失变异株,结果显示缺失变异株对检测引物能产生荧光响应而对鉴别引物的荧光定量分析无荧光响应,非缺失变异株对检测引物及鉴别引物均能产生荧光响应。表明本方法具有良好的鉴别诊断特异性。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,建立了PRRSV缺失变异株与非缺失变异株的标准曲线及其直线回归方程,确定其最佳读板温度。以上结果表明该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为鉴别诊断及分析PRRSV缺失变异株与非缺失变异株感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。
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