【摘 要】
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目的 构建树鼩载脂蛋白AV原核表达载体并利用His标签纯化该蛋白.方法 从树鼩肝细胞中提取总RNA,经逆转录合成cDNA第一链,以cDNA第一链为模板,扩增载脂蛋白AV基因.PCR扩增
【机 构】
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南昌市第三医院内分泌代谢科,江西省南昌市330009
【出 处】
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第十二次全国动脉硬化性疾病学术会议
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目的 构建树鼩载脂蛋白AV原核表达载体并利用His标签纯化该蛋白.方法 从树鼩肝细胞中提取总RNA,经逆转录合成cDNA第一链,以cDNA第一链为模板,扩增载脂蛋白AV基因.PCR扩增产物和pET32a原核表达载体经过双酶切,将纯化回收的酶切产物按适当的摩尔比通过T4 DNA连接酶16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10,挑克隆测序.将克隆成功的载脂蛋白AV重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,并优化诱导条件.表达的载脂蛋白AV经镍离子螯合树脂纯化,采用BCA法分析蛋白浓度,纯度测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合薄膜凝胶扫描分析获得.结果 挑选的克隆经测序证实载脂蛋白AV基因已经成功连接入pET32a原核表达载体中.在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导表达,有分子量大小约60kDa的特异性蛋白产生,与预期大小一致.重组蛋白诱导的最佳表达时间为5h左右,最佳浓度约在20 μmol/L.镍离子螯合树脂柱亲和层析获得的纯化蛋白,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后薄膜凝胶扫描分析显示目的蛋白的纯度在95％以上.结论 成功构建了载脂蛋白AV的原核表达载体,该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达,纯化后的载脂蛋白AV纯度约95％,为进一步研究其结构与功能奠定了基础.
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