论文部分内容阅读
精原干细胞(SSCs)的形成为精子的发生提供了基础.成纤维细胞生长因子家族对SSCs的形成至关重要,FGF8调控SSCs生成的功能需要深入研究.
目的：本试验旨在研究FGF8对鸡胚胎干细胞(ESCs)向精原干细胞分化的作用,为进一步提高SSCs体外诱导效率,研究SSCs形成的分子调控机制奠定理论基础.
方法：前期利用RNA-seq技术对胚胎干细胞(ESCs)、原始生殖细胞(PGCs)和精原干细胞(SSCs)转录本进行高通量测序,分析筛选了SSCs发育分化过程的关键生长因子;在体外ESCs分化为SSCs模型中对FGF8进行过表达和干扰处理,观察细胞的形态变化.通过qRT-PCR、细胞免疫化学和流式细胞分析检测PGCs和SSCs的标记基因表达以及生成效率;在体内,通过胚盘注射方法对FGF8过表达和干扰处理,研究FGF8对鸡SSCs形成的影响.
结果：结果表明:在ESCs向SSCs分化过程中共检测到6078个差异表达基因,其中包括大量生长因子家族(TGFB、EGF、GDNF、FGF等),qRT-PCR显示FGF8表达趋势与RNA-seq中的结果一致.体外模型中,敲低FGF8,生殖标记基因Cvh(2.55±0.121)、Integrinα6(2.396±0.154)表达量与对照组相比显著上调(P＜0.01),而过表达FGF8显著上调Nanog(1.453±0.093)、Cvh(1.432±0.082),但极显著下调Integrinα6(0.782±0.043)(P＜0.01);干扰FGF8后CVH+细胞(5.3％±0.25)和Integrinα6+细胞(7.9％±0.45)的比例显著高于对照组(4.4％±0.23和4.3％±0.21;P＜0.01).鸡胚盘注射实验中,敲低FGF8,生殖标记基因Cvh(7.914±0.471)、Integrinα6(5.066±0.362)表达量均呈极显著上调(P＜0.01);同时,CVH+细胞(16.6％±1.02)和Integrinα6+细胞(7.54％±0.43)显著高于对照组(10.48％±0.93和6.07％±0.37;P＜0.01);过表达FGF8后Cvh(1.136±0.083)显著上调,Integrinα6(0.632±0.043)表达量极显著下调,CVH+细胞比例(23.5％±1.13)显著高于对照组(20.1％±1.24;P＜0.05),极显著低于干扰组(26.2％±1.43;P＜0.01)。
结论：结果表明FGF8在鸡ESCs向SSCs分化过程为负调控作用,敲低FGF8,能够促进鸡ESCs向SSCs的分化,而过表达FGF8能促进PGCs的自我更新,同时抑制其向SSCs分化.