论文部分内容阅读
目的:动物源性材料已被广泛应用于组织工程和再生医疗领域.动物组织内广泛存在一种含有半乳糖基糖蛋白或糖脂肪的细胞膜抗原(Gal抗原),这种抗原由于人类的半乳糖基转移酶基因(a-1,3-GT)存在两个碱基错位不表达在人类组织.因此,动物源性材料中的Gal抗原成为引起人体强烈免疫排斥反应以及慢性免疫毒性反应和钙化的主要原因,而这种特殊的免疫毒性无法用野生型动物来评价.本研究旨在研发一种模拟人体不表达Gal抗原的模型动物,用于动物源性材料或异种器官的免疫毒性评价.本报告将介绍研发模型动物时重组a-1,3-GT-/-小鼠胚胎细胞(C57 ES)的构建.
方法:将PCR扩增的小鼠a-1,3-GT基因(GGTA1)功能区(Exon9)的上游同源片段、抗生素耐药基因(Neon-PA)片段和下游同源片段经过重复亚克隆、得到pL452-A-Neon-B质粒，再将其电转至含细菌人上染色体(BAC)的细菌进行重组，最后亚克隆进携带同源臂的pDTA-GGTA1下游载体，构建打靶载体。利用同源重组方法，将打靶载体导入C57BL小鼠来源的胚胎干细胞，置换野生型小鼠胚胎干细胞的半乳糖基转移酶基因，获得重组干细胞仁阳性克隆);然后将重组干细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植入假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠;再经与野生型回交获得F1代杂合子，杂合子之间交配繁殖即可得到基因敲除的纯合子模式小鼠。
结果和结论:利用BAC重组技术成功构建了pDTA-GGTA1-Neon重组载体。将此打靶载体进行ES细胞转染后成功获得了携带a-1,3-GT+/-的C57 ES阳性克隆。