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在植物的生长和发育中,一些非编码的小RNA分子不仅介导了转录后水平的RNA干涉作用,而且对转录水平的染色质修饰起着重要的调控作用.在这些过程中,与小RNA合成相关的蛋白因子DCLs,AGOs和RDRs分别发挥着十分重要的作用.本文利用生物信息学方法,以葡萄最新基因及蛋白序列为材料,通过对葡萄DCLs,AGOs和RDRs基因进行鉴定,以期获得较为完整的葡萄DCLs,AGOs和RDRs基因家族信息.同时对该家族成员的分类、定位、进化、EST、基因复制和表达等情况进行全面分析.本文主要研究结果如下:
1、运用多种生物信息学的软件对葡萄的全基因组进行搜索、比对和筛选,同时结合Pfam在线工具,共获得4个编码DCL蛋白的基因(VvDCL),13个编码AGO蛋白的基因(VvAGO),5个编码RDR蛋白的基因(VvRDR).这些基因序列的整合比对分析可知典型的结构域,DCLs基因含有六个结构域,即DExD, Helicase-C,DUF283,PAZ,RNaseⅢ和dsRB结构域.AGOs基因含有三个结构域,即DUF1785,PAZ和PIWI结构域,RDRs基因只含有一个RdRP结构域.其中,在AGOs基因中的PIWI结构域中存在着一些保守的金属螯合氨基酸位点(DDH)和一个保守的组氨酸(H798)位点,这对AGO1蛋白行使体外内切酶活性时非常重要,在13个鉴定的VvAGO蛋白的PIWI结构域中,有6个VvAGO蛋白具有保守的DDH/H798位点,然而,另外的7个VvAGO蛋白不同程度地丧失掉这些重要的酶活位点,预示这些蛋白的酶活功能可能丧失.
2、通过构建系统进化树分析葡萄、拟南芥、水稻和西红柿中这些功能基因家族的进化关系,结果显示葡萄、拟南芥、水稻和西红柿都进化成了四个不同的亚族,但在进化上葡萄和西红柿的同源基因比拟南芥和水稻具有更近的亲缘关系.参考水稻和西红柿DCLs, AGOs和RDRs基因家族的命名方法,根据其同源性对葡萄的DCLs,AGOs和RDRs基因家族进行了命名.
3、确定葡萄DCLs,AGOs和RDRs基因在染色体上的起始位置,进行染色体物理位置的定位绘制,结果显示22个DCLs,AGOs和RDRs基因分散的分布在葡萄的11条染色体上,4个VvDCL基因分布于3条染色体上,13个VvAGO基因分布在9条染色体上,5个VvRDR基因位于4条染色体上.其中,发现5对基因有基因复制现象,三对旁系同源基因(VvAGO10a/-10b,VvAGO4/-8,VvAGO5/-9)被发现是片段复制,VvAGO2a/-2b/-3和VvRDR1a/-1b被发现两对是串联复制基因.
4、利用微阵列技术,对葡萄各个阶段在非生物胁迫压力(盐、水不足)情况下进行分析,获得葡萄DCL、AGO和RDR基因家族电子表达谱,这些基因在不同的胁迫处理下表现出差异性的表达水平.结果表明大部分基因在两种胁迫压力的不同阶段中出现较高的表达量,只有VvDCL4、VvAGO2b、VvAGO10a和VvRDR3只在盐或水不足的某个阶段显示出较高的表达量,而在其它阶段都表现出极低的表达量.