论文部分内容阅读
目的：应用SSH技术构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库，筛选、鉴定出转移相关基因的cDNA片段的基础上，对筛选鉴定得到的消减cDNA文库中差异表达的基因进行文献检索、比对及进一步验证，为进一步发现和研究潜在的肺癌转移相关基因提供新的思路和新的视角。方法:(1)应用SSH技术，以人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980和人高转移大细胞肺癌细胞株L9981为研究对象，构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库;(2)应用蓝白菌落及PCR技术筛选获得阳性克隆，应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选，确定差异表达片段对应的克隆;(3)对差异表达的片段进行序列分析，并将序列分析结果通过NCB工核昔酸数据库BLAST信息途径，进行同源性检索和比对;(4)将上述初步筛选鉴定得到的候选差异表达基因在文献中进行检索和聚类分析，探索各差异表达基因的功能及其与肿瘤的潜在联系;(5)应用实时荧光RT-PCR检测初筛后的各差异表达基因的mRNA表达情况;结果:(1)成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库;(2)经蓝白菌落筛选和斑点杂交获得阳性克隆，正向消减文库挑选55个克隆成功测序，经同源性分析最终确定差异表达基因片段23个与已知人类全长基因具有很高相似性;反向消减文库挑选31个克隆成功测序，经同源性检索和比对最终确定差异表达基因片段16个，其中15个与人类全长基因具有很高相似性;(3)对经SSH初筛的差异表达基因进行文献检索及聚类分析，在正向消减文库及反向消减文库的34个差异表达基因中，有6个基因被报道与肿瘤发生、发展、凋亡或耐药性的获得相关，有5个基因被报道与肿瘤侵袭转移相关;(4)对正向消减文库及反向消减文库中的差异基因进行实时荧光RT-PCR检测，有12个基因的mRNA在人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980和人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中的表达具有显著性差异,且与SSH结果相符，其中ANXA2,KRT18和ACTG1的差异性表达在2倍以上;结论:应用抑制消减杂交技术成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库;在正向消减和反向消减文库中筛选到34个差异表达基因，其中有6个基因可能与肿瘤产生、发展和凋亡相关，有5个基因可能与肿瘤侵袭转移性相关;差异表达基因ANXA2和ACTG1 mRNA和蛋白在人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中的表达水平均显著高于人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980;ANXA2和ACTG1可能是与肺癌侵袭转移相关的候选基因之一。