【摘 要】
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目的 构建过表达生长分化因子5(GDF5)同时基因沉默锌离子转运蛋白(ZIP8)的双重功能慢病毒载体，检测其在诱导多能干细胞中的表达效率并建立稳定细胞系，为骨关节炎的细胞治疗提供种子细胞奠定相关研究基础.方法 以人的GDF5 cDNA为模板合成GDF5全长序列，设计合成靶向小鼠ZIP8的shRNA 序列，依次分别与AgeⅠ/XbaⅠ、BamhⅠ\XhoⅠ双酶切的载体pRNAU6.2相连，构建双重功
【出 处】
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中华医学会第十八届骨科学术会议暨第十一届COA国际学术大会
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目的 构建过表达生长分化因子5(GDF5)同时基因沉默锌离子转运蛋白(ZIP8)的双重功能慢病毒载体，检测其在诱导多能干细胞中的表达效率并建立稳定细胞系，为骨关节炎的细胞治疗提供种子细胞奠定相关研究基础.方法 以人的GDF5 cDNA为模板合成GDF5全长序列，设计合成靶向小鼠ZIP8的shRNA 序列，依次分别与AgeⅠ/XbaⅠ、BamhⅠ\XhoⅠ双酶切的载体pRNAU6.2相连，构建双重功能慢病毒载体.对质粒进行测序及序列比对，验证重组克隆中插入片段序列与设计的寡核苷酸序列是否一致.将重组质粒及阴性对照质粒分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T 细胞，收集病毒上清后感染iPSCs 细胞，实时定量 PCR和 免疫印迹分别检测GDF5蛋白和ZIP8 mRNA的过表达水平与沉默效果.经G418 筛选获得稳定高效表达GDF5与基因沉默ZIP8 的诱导多能干细胞(iPSCs)稳定细胞株.
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