论文部分内容阅读
目的：研究BMP信号系统在肠神经节细胞、肠平滑肌组织发生、分化、增殖中的作用,揭示肠无神经节细胞症的发病原因。方法：①获取肠神经嵴干细胞(ENSCs),鉴定干细胞特性(Nestin、P75、CD49d+),采用原代培养及免疫荧光技术检测BMP对ENSCs传代、分化、增殖、迁移的影响。②采用特异性针对BMP的Morphplino于斑马鱼胚胎1-2细胞期进行显微注射,下调BMP表达,观察神经嵴干细胞迁移、分化、增殖的影响,研究不同时间点阻断BMP对肠神经系统的发育的影响,观察下调BMP对斑马鱼平滑肌发育的影响,观察BMP下调后对下游相关易感基因GDNF的影响。③采用孕鼠跨胎盘RNAi技术研究BMP下调后,小鼠肠无神经节细胞症的建立及对肠神经系统发育的影响。④检测肠无神经节细胞症患者术后病理组织系统研究。结果：①采用P75、CD49d+双标获得肠神经峙干细胞阳性率为5.09%, BMP能够促进神经峭干细胞的增殖、迁移及成熟，促进神经介质分泌，GDNF可增强其生物学效应。BMP上述作用依赖于经典BMP/Smadl/Smad4信号通路。②来源于神经峰头端腹侧神经峪干细胞群从头端向尾端迁移，迁移至食管、胃、十二指肠、小肠速度较快，结肠迁移速度显著减缓，神经干细胞的增殖、分化贯穿于迁移的全过程。通过热激活BMP或 BMP过表达可拯救发育滞后的神经节细胞。斑马鱼的肠平滑肌发育稍早于肠神经系统的发育，纵肌与横肌同时进行，BMP下调显著阻滞神经峙干细胞的分化、迁移、发育和成熟。同时也滞后相应节段的肠平滑肌发育。③通过孕鼠尾静脉注射BMP干扰质粒，通过血胎屏障进入胎鼠，BMP下调后，胎鼠发育滞后，颅面、眼、心血管系统发育较差，部分小鼠有典型的肠无神经节细胞症表型改变，腹胀、阶段性结肠扩张、扩张远端可见痉挛结肠。痉挛段结肠壁薄、神经节细胞缺失，钙视网膜蛋白(CR)阳性表达，具有典型的无神经节细胞症特点。④先天性肠无神经节细胞症患儿病变组织病理学检测BMP2表达特点，痉挛段神经丛为0.067单位，移形段、扩张段及正常段分别为0.106, 0.187,0.204, BMP2在肌层的表达，痉挛段为0.049，移形段、扩张段及正常段分别为0.098, 0.153,0.164,痉挛段与正常结肠比较均有统计学差异。结论：① BMP2在无神经节细胞症的发生中有重要作用，集中表现在BMP2维持正常的肠神经系统的正常发育，保证结肠纵肌与横肌的正常功能，BMP2还是GDNF等维持神经、横纹肌正常结构重要因子的调节因素。②本研究显示，先天性无神经节细胞症的病因包括三个因素：结肠肠壁肌间神经节细胞缺失、病变结肠原发性肌层(纵肌与横肌)发育异常、维持肠神经、肌肉系统正常发育的GDNF等营养因子的异常。