一种新型的大丽轮枝菌葡聚糖-1,3-β-糖苷酶的表达和性质研究

• 作 者: 孙瑶 杨晓杰 侯甲男 唐中杰 赵元明 谢德意 李
• 发表日期: 2017年期
• 关键词: 棉花 黄萎病 杀菌剂 大丽轮枝菌 葡聚糖-1 3-β-糖苷酶 纯化

棉花黄萎病是1种严重的真菌性病害,每年给我国农业生产造成重大经济损失。大丽轮枝菌的休眠结构微菌核,是黄萎病最重要的初侵染源,它致病力强,寄主范围广,存活时间长。微菌核的萌发（膨胀与产生分支）与细胞壁的代谢过程息息相关。细胞壁是细菌、真菌和植物细胞的特有结构,以细胞壁代谢途径中的调控酶为靶标研制的杀菌剂,不会对人体和动物产生直接影响。分子生物学和基因工程研究表明:葡聚糖-1,3-B-糖苷酶（BG2）在细胞壁消解途径中起关键作用,可作为潜在的杀菌剂靶标。克隆大丽轮枝菌的BG2基因,并在大肠杆菌中进行异源表达,最终获得相对分子质量为45kDa的BG2。对BG2表达过程中,诱导剂的浓度、诱导温度、诱导时间均作了优化。IPTG浓度为0.5mmol·L^-1,25℃诱导6 h,可以获得最大表达量的BG2。收集培养的菌体并裂解离心后,1 L培养基中生产1264 mg可溶性蛋白,BG2表达的目的蛋白主要为可溶性蛋白。经过裂解离心、亲和层析、凝胶过滤层析、超滤4个纯化步骤后,最终1 L培养基得到0.06 mg BG2,纯化效率为0.09%,蛋白纯度高达95%。BG2产量较低的原因可以归结为目的蛋白与Ni-NTA树脂亲和能力不强,导致部分目的蛋白没有与金属离子形成螯合物就直接通过层析柱流失了。另外,以pNPG为底物,测试大丽轮枝菌BG2的活性,同时对其活性测试条件进行优化。在pH7.5的缓冲溶液中,30℃温浴反应5 min,可以使大丽轮枝菌BG2活性达到最大35.2 U·mg^-1。大丽轮枝菌BG2的克隆、表达及其产物的纯化以及活性测试工作为其抑制剂的设计及抑制活性的测试奠定基础,为我国黄萎病新型杀菌剂的研制工作提供基础数据与关键理论。