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目的：了解不同浓度吡格列酮(pioglitazone,PIO)对高糖诱导下血管内皮细胞(vasculaur endothelial cell,VEC)增殖及产生一氧化氮(nitric oxide,No)、内皮素(endothelin,ET-1)的影响,并探讨其对高糖诱导下血管内皮细胞内产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影响和对细胞凋亡的保护作用,以及其对c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N terminal kinase,JNK)表达和磷酸化的影响。
方法：将处于对数生长期的VEC随机分为6组,分别为A组：正常对照组(Glu 5.5mmol/l)；B组：高糖组(Glu 33mmol/l)；C组：高糖+低浓度PIO组(PIO 1×10-8mmol/L)；D组：高糖+中浓度PIO组(PIO 1×10-6 mmol/L)；E组：高糖+高浓度PIO组(PIO 1×10-4mmol/L)；F组：高糖+SP600125组(SP600125,10.0μmmol/L).其中F组先用10.0 μmmol/LSP600125预处理1h再加高糖继续培养18h,仅在Western-blot检测。INK、p-JNK蛋白表达时加入该组。①取体外培养的VEC,在含不同浓度PIO(1×10一mmol/L、l×10-6mmol/L、1×10-4mmol/L)的低糖(Glu 5.5mmol/L)及高糖(Glu33mmol/L)培养基中分别培养6h,12h,18h,24h,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法确定PIO抑制VEC细胞增殖作用的最佳作用时间.②用硝酸还原酶法测定培养液中NO的水平,用放射免疫法测定ET-1的水平。③利用荧光探针DCFH-DA检测各组细胞.ROS的水平。④采用Annexin V/PI双染法检测各组细胞凋亡率。⑤Western-blot检测各组血管内皮细胞JNK、p-JNK蛋白的表达,观察不同浓度PIO作用下JNK磷酸化水平的变化。
结果：①与正常对照组相比,高糖组VEC增殖明显减弱；与高糖组比较,PIO作用同一时间点时均可使‘VEC增殖明显增强(P<0.05),且呈浓度一效应依赖关系；同一剂量不同时间点与高糖组比较,PIO孵育后内皮细胞增殖均增强,其中6h时轻度增加,18h增强最为明显,培养至24h时细胞增殖能力略有下降.②与正常对照组相比,高糖组NO水平明显下降,ET-1水平明显上升；与高糖组比较,PIO可使高糖诱导下的VEC培养上清液中NO浓度明显升高(P<0.05),ET-l浓度明显降低(P<0.05),且呈浓度一效应依赖关系。③与正常对照组相比,高糖组ROS水平显著升高(P<0.05)；与高糖组相比,PIO可减少VEC内的ROS水平,呈浓度一效应依赖关系。④与正常对照组相比,高糖组的早期凋亡率和晚期凋亡率均明显升高(P<0.05)；与高糖组相比,中浓度PIO(1×10-6mmol/L)及高浓度PIO(1×10-4mmol/L)均能使VEC凋亡均明显减少(P<0.05),呈浓度一效应依赖关系。⑤与正常对照组相比,高糖组JNK磷酸化水平明显上升,有显著性差异(P<0.05)；PIO可明显抑制VEC内的p-JNK表达(P<0.05),且呈浓度一效应依赖关系。与高糖组比较.JNK抑制剂SP600125干预后p-JNK表达减少,差异有显著性(P<0.05)。
结论：PIO能够明显抑制高糖诱导引起的VEC凋亡,增加NO的合成,减少ET-1的分泌和ROS的产生,降低JNK磷酸化水平。JNK抑制剂SP600125预处理后,VEC的p-JNK表达显著减少,PIO抑制血管内皮细胞凋亡的作用有可能是通过影响JNK通路来实现的。
方法：将处于对数生长期的VEC随机分为6组,分别为A组：正常对照组(Glu 5.5mmol/l)；B组：高糖组(Glu 33mmol/l)；C组：高糖+低浓度PIO组(PIO 1×10-8mmol/L)；D组：高糖+中浓度PIO组(PIO 1×10-6 mmol/L)；E组：高糖+高浓度PIO组(PIO 1×10-4mmol/L)；F组：高糖+SP600125组(SP600125,10.0μmmol/L).其中F组先用10.0 μmmol/LSP600125预处理1h再加高糖继续培养18h,仅在Western-blot检测。INK、p-JNK蛋白表达时加入该组。①取体外培养的VEC,在含不同浓度PIO(1×10一mmol/L、l×10-6mmol/L、1×10-4mmol/L)的低糖(Glu 5.5mmol/L)及高糖(Glu33mmol/L)培养基中分别培养6h,12h,18h,24h,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法确定PIO抑制VEC细胞增殖作用的最佳作用时间.②用硝酸还原酶法测定培养液中NO的水平,用放射免疫法测定ET-1的水平。③利用荧光探针DCFH-DA检测各组细胞.ROS的水平。④采用Annexin V/PI双染法检测各组细胞凋亡率。⑤Western-blot检测各组血管内皮细胞JNK、p-JNK蛋白的表达,观察不同浓度PIO作用下JNK磷酸化水平的变化。
结果：①与正常对照组相比,高糖组VEC增殖明显减弱；与高糖组比较,PIO作用同一时间点时均可使‘VEC增殖明显增强(P<0.05),且呈浓度一效应依赖关系；同一剂量不同时间点与高糖组比较,PIO孵育后内皮细胞增殖均增强,其中6h时轻度增加,18h增强最为明显,培养至24h时细胞增殖能力略有下降.②与正常对照组相比,高糖组NO水平明显下降,ET-1水平明显上升；与高糖组比较,PIO可使高糖诱导下的VEC培养上清液中NO浓度明显升高(P<0.05),ET-l浓度明显降低(P<0.05),且呈浓度一效应依赖关系。③与正常对照组相比,高糖组ROS水平显著升高(P<0.05)；与高糖组相比,PIO可减少VEC内的ROS水平,呈浓度一效应依赖关系。④与正常对照组相比,高糖组的早期凋亡率和晚期凋亡率均明显升高(P<0.05)；与高糖组相比,中浓度PIO(1×10-6mmol/L)及高浓度PIO(1×10-4mmol/L)均能使VEC凋亡均明显减少(P<0.05),呈浓度一效应依赖关系。⑤与正常对照组相比,高糖组JNK磷酸化水平明显上升,有显著性差异(P<0.05)；PIO可明显抑制VEC内的p-JNK表达(P<0.05),且呈浓度一效应依赖关系。与高糖组比较.JNK抑制剂SP600125干预后p-JNK表达减少,差异有显著性(P<0.05)。
结论：PIO能够明显抑制高糖诱导引起的VEC凋亡,增加NO的合成,减少ET-1的分泌和ROS的产生,降低JNK磷酸化水平。JNK抑制剂SP600125预处理后,VEC的p-JNK表达显著减少,PIO抑制血管内皮细胞凋亡的作用有可能是通过影响JNK通路来实现的。