论文部分内容阅读
【研究背景】叶绿体是一种拥有自己基因组的半自主的细胞器,植物体内最重要的细胞器之一,是植物进行光合作用和蛋白质、脂肪、核酸等重要物质合成和代谢等生理过程的场所。由于叶绿体拥有自己的基因组,因此可以对它进行遗传转化。叶绿体转化与细胞核转化相比具有多重优势,包括基因拷贝数高客户死先外源基因大量表达、可以实现外源基因的定点整合、可实现多基因的一步转化和环境安全性高等。叶绿体转化可以在提高作物抗病、抗虫性,品质改良等作物遗传改良和植物植物生物反应器中有重要应用,也可以在光合作用和次生代谢机理等基础研究领域有重要应用。【材料与方法】以水稻、紫花苜蓿和烟草等为材料,利用基因枪轰击法,把含有外源基因的载体导入叶绿体中;通过筛选获得再生植株后,经PCR、Southem杂交等分子检测,结合报告基因绿色荧光蛋白基因的表达情况,确定叶绿体转化植株及其同质化进程,获得同质化叶绿体转基因材料;最后通过Western杂交等方法测定外源基因的表达,并对外源基因表达产物的功能进行分析。【结果与分析】从多个筛选水稻自交系中筛选获得了愈伤组织可长期继代而分化率高、白化苗率低的材料用于水稻叶绿体转化,突破了水稻叶绿体转化的瓶颈,成功把绿色荧光蛋白基因插入水稻叶绿体基因组的trnI和trnA之间,建立了水稻叶绿体转化体系,并获得转绿色荧光蛋白基因的水稻材料;经PCR和Southem杂交检测,转基因材料首次达到同质化,外源蛋白得到表达。率先建立了紫花苜蓿叶绿体转化体系,成功把绿色荧光蛋白基因插入紫花苜蓿叶绿体基因组的trnI和tmA之间,经PCR和Southem杂交检测,确认转基因材料达到同质化,外源基因GFP达到了表达。建立了烟草叶绿体转化体系,获得多个药用蛋白基因的同质化叶绿体转基因植株,其中hbFGF(人碱性成纤维细胞生长因子)、hFGF21(人成纤维细胞生长因子21)和hBDNGFb(人脑源性神经生长因子b)属于首次成功转化叶绿体并实现表达;在烟草叶绿体中实现hFGF21和hBDNGFb和hEGF(人表皮生长因子)的高效,表达量均在总可溶性蛋白的10%以上;成功分离纯化了这三个蛋白,细胞增殖实验表明,其与市场上的相应的重组蛋白的活性相当;获得了转抗菌肽MSI99的同质化叶绿体中转基因烟草,转基因烟草对赤星病具有抗性,转基因的提取物对稻瘟病病原菌用抑制作用。【结论】成功建立了水稻和紫花苜蓿叶绿体转化体系,为后续的应用研究奠定了技术基础。叶绿体转化技术可以应用到在植物生物反应器中表达高附加值药用蛋白,并可以在提高作物抗病性中起到作用。