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高通量、高精准的差异蛋白质组方法的发展对于筛选疾病蛋白质候选标志物意义重大；进一步地,从大量候选标志物中准确验证出可用于临床诊疗的标志物更是亟需发展新方法。差异蛋白质组研究所采用方法的准确度、灵敏度直接决定了筛选到的差异蛋白质的可靠性。我们发展了一系列基于成对离子的二级质谱定量新方法,从适合细胞来源的样本定量的方法IVTAL[1]到适合组织样本的定量QITL[2]和G-IVTAL[3],以及相应的定量软件[4]。该系列方法利用二级质谱中所有b,y离子进行定量,消除了传统二级质谱利用报告离子定量时低端质量的信号抑制效应,且由于多对离子同时提供定量信息,显著提高了定量准确度和灵敏度,将定量变异系数从50％左右降低到20％以内,成功应用于肝癌、肠癌等疾病蛋白质组的相对定量分析。为在准确筛选的基础上提高通量,最近,我们进一步在前期工作基础上建立了3标的串级质谱定量方法,不仅保证了准确性还提高了一次实验可分析的样本量。差异蛋白质组研究产生的大量候选蛋白质标志物,最终是否能真正成为具有临床意义的标志物需要经过严格的验证,但目前最先进的MRM-MS的验证技术主要存在通量不高的问题。我们发展了联合使用iTRAQ/mTRAQ标记技术和MRM-MS技术的阵列MRM-MS策略,使用mTRAQ试剂标记内标肽段,并同时用4标的iTRAQ试剂对待验证样本进行标记,通过产生的MRM谱图可以得到四组样品中目标肽段的总量,然后再根据串级谱图中报告离子的信号得到四组样品中目标肽段量的比值信息,结合总量以及四组样品的比值,一次实验即可以得到四组样品中目标肽段的定量信息,建立了当时文献报道的最高通量MRM-MS验证策略。在37例早期肠癌组织样中准确验证了lysozyme C(LYZ)随着癌症的发展逐渐增加,ademosylhomocysteinase(AHCY)在Ⅱ期上调明显等重要蛋白质的变化,为大肠癌的早诊提供了基础[5]。最近,我们联合多重标记技术,将一次验证的样品通量扩展到了20组以上,将进一步提供更高通量的蛋白质候选标志物验证新方法。