【摘 要】
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目的： 构建人源三价砷甲基转移酶(AS3MT)的基因逆转录病毒表达载体,转导UROtsa细胞,建立稳定表达的细胞系. 方法： 采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),从人源HEK293细
【机 构】
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广东省职业病防治院毒理实验所,广东省职业病防治重点实验室,广东广州510300
【出 处】
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广东省职业健康协会第三届学术交流会
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目的：
构建人源三价砷甲基转移酶(AS3MT)的基因逆转录病毒表达载体,转导UROtsa细胞,建立稳定表达的细胞系.
方法：
采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),从人源HEK293细胞基因库中扩增出AS3MT基因,将AS3MT基因克隆到逆转录病毒表达载体pRetroX-IRES-ZsGreen1中,经病毒包装后,转导UROtsa细胞,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用流式细胞仪筛选阳性克隆,半定量RT-PCR法检测AS3MTmRNA表达水平,免疫印迹法检测其蛋白表达水平.
结果：
经RT-PCR扩增AS3MT基因、限制性双酶切及基因测序鉴定,证实AS3MT基因正确插入逆转录病毒表达载体.以该载体转染病毒包装细胞RetroPack PT67后获得的病毒液滴度＞106 cfu/mL.将病毒转导UROtsa细胞,转导效率达50.00％.经3次流式细胞分选仪筛选,所有细胞均可见绿色荧光;半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果均表明所转导的AS3MT基因在UROtsa细胞中成功表达.
结论：
成功构建高水平稳定表达AS3MT基因的UROtsa细胞系,为研究AS3MT在砷的代谢、毒性和致癌性中的作用机制奠定基础.
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