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目的：利用基因重组技术构建表达抗EGFR单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白ER(Fv-LDP)，研究其对EGFR高表达肿瘤细胞的体外抑制作用和体内抗肿瘤活性。
方法：用PCR方法扩增抗EGFR单链抗体基因，并将其连接至含有力达霉素辅基蛋白基因的重组质粒pET-LDP，构建含有融合蛋白基因的重组质粒pET-Fv-LDP。转化到大肠杆菌BL21(DE3)starTM中，IPTG诱导表达带有组氨酸标签肽(His-tag)的融合蛋白ER(Fv-LDP)。用Ni离子亲和柱对融合蛋白进行纯化。运用ELISA、流式细胞术和MTT方法研究融合蛋白对EGFR不同表达水平肿瘤细胞的亲和能力及体外抑制作用。用人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤进行融合蛋白体内抗肿瘤活性研究。
结果：(1) SDS-PAGE电泳显示融合蛋白ER(Fv-LDP)分子量约为38kDa，主要以包涵体形式表达，表达量约为全菌蛋白的8%。ELISA检测结果表明融合蛋白与EGFR高表达的鳞癌A431细胞和肺癌A549细胞有较强的结合能力，亲和常数分别为1.0×lO8M-1和1.8×108M-1。流式细胞周期测定结果表明融合蛋白可将细胞周期阻滞于G2/M期。MTT结果显示，融合蛋白对EGFR高表达肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，其作用于A431和A549细胞的IC50值分别为1.3×10-7M和8.4×10-8M。 O.5mg/kg和5mg/kg两个剂量的融合蛋白对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的抑制率分别为51.4%和67.5%，高于力达霉素辅基蛋白组(5 mg/kg)的抑制率16.3%，且裸鼠体重未有明显差异。
结论：融合蛋白ER(Fv-LDP)对EGFR高表达的肿瘤细胞具有较强的亲和力，能够引起细胞周期G2/M期阻滞，对EGFR高表达肿瘤细胞A431和A549具有体外杀伤作用；对EGFR高表达的人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤有显著抑制作用，有望成为一种具有应用前景的抗体导向药物。
方法：用PCR方法扩增抗EGFR单链抗体基因，并将其连接至含有力达霉素辅基蛋白基因的重组质粒pET-LDP，构建含有融合蛋白基因的重组质粒pET-Fv-LDP。转化到大肠杆菌BL21(DE3)starTM中，IPTG诱导表达带有组氨酸标签肽(His-tag)的融合蛋白ER(Fv-LDP)。用Ni离子亲和柱对融合蛋白进行纯化。运用ELISA、流式细胞术和MTT方法研究融合蛋白对EGFR不同表达水平肿瘤细胞的亲和能力及体外抑制作用。用人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤进行融合蛋白体内抗肿瘤活性研究。
结果：(1) SDS-PAGE电泳显示融合蛋白ER(Fv-LDP)分子量约为38kDa，主要以包涵体形式表达，表达量约为全菌蛋白的8%。ELISA检测结果表明融合蛋白与EGFR高表达的鳞癌A431细胞和肺癌A549细胞有较强的结合能力，亲和常数分别为1.0×lO8M-1和1.8×108M-1。流式细胞周期测定结果表明融合蛋白可将细胞周期阻滞于G2/M期。MTT结果显示，融合蛋白对EGFR高表达肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，其作用于A431和A549细胞的IC50值分别为1.3×10-7M和8.4×10-8M。 O.5mg/kg和5mg/kg两个剂量的融合蛋白对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤的抑制率分别为51.4%和67.5%，高于力达霉素辅基蛋白组(5 mg/kg)的抑制率16.3%，且裸鼠体重未有明显差异。
结论：融合蛋白ER(Fv-LDP)对EGFR高表达的肿瘤细胞具有较强的亲和力，能够引起细胞周期G2/M期阻滞，对EGFR高表达肿瘤细胞A431和A549具有体外杀伤作用；对EGFR高表达的人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤有显著抑制作用，有望成为一种具有应用前景的抗体导向药物。