【摘 要】
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滞育是多数昆虫应对不良环境做出的适应性行为,并在长期进化过程中成为固有的遗传属性,有助于种群的延续繁衍.深入研究七星瓢虫的滞育机制,掌握滞育诱导、维持、解除技术,进而促进其规模化室内人T繁殖,有效应用于农林业的生物防治实质工作中.因此,研究滞育调控、分子机理T作愈加受到重视.利用抑制性消减杂交技术构建了质量合格的抑制性消减杂交( SSH)文库,得到多个差异表达的EST,由于抑制性消减杂交文库筛选出
【机 构】
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中国农业科学院植物保护研究所/国家农业生物安全中心/农业部作物有害生物综合治理重点实验室,北京 100081;中美合作生物防治实验室,北京 100081;福建农林大学,福州 350002
【出 处】
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中国植物保护学会2014年学术年会
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滞育是多数昆虫应对不良环境做出的适应性行为,并在长期进化过程中成为固有的遗传属性,有助于种群的延续繁衍.深入研究七星瓢虫的滞育机制,掌握滞育诱导、维持、解除技术,进而促进其规模化室内人T繁殖,有效应用于农林业的生物防治实质工作中.因此,研究滞育调控、分子机理T作愈加受到重视.利用抑制性消减杂交技术构建了质量合格的抑制性消减杂交( SSH)文库,得到多个差异表达的EST,由于抑制性消减杂交文库筛选出的差异表达基因具有一定的假阳性,需要进一步筛选.反向Northern杂交技术可进一步高通量筛选差异表达基因,此方法制备探针没有同位素污染,在带正电的尼龙膜上可同时进行数百个杂交反应,进行斑点杂交不需要特殊设备,反应灵敏,筛选效率高.使用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ (Roche),将正向文库和反向文库的二次PCR(巢式PCR)产物进行有效标记制备成两种探针.经过探针标记效率检测来对杂交的探针浓度进行定性.取菌落PCR检测为阳性的克隆2μl,加入等量新配置的0.6M的氢氧化钠进行变性10min,一式两份在两张膜的同一个位点逐一进行点膜,点膜体积为1μl,以七星瓢虫的p-actin基因做阳性对照,变性液为阴性对照,点完后在中性液中中和lOmin.干燥膜后,将膜放在被10×SSC溶液润湿的whatman上,紫外交联仪中进行DNA固定或者将中和后的膜直接放在180℃下烘烤2h.固定DNA后,将膜放置于两种不同探针的杂交溶液中过夜杂交(膜要始终保持湿润),将膜经过一系列的溶液冲洗后进行免疫检测,然后在膜上滴加显色液并密封于杂交袋中(不能有气泡,防止背景干扰),暗室中进行x光片曝光20min,显影和定影后干燥,扫描光片.比较光片上同一位点上的杂交信号强度.选择杂交信号强度相差3倍以上的克隆进行测序,将得到的EST提交到NCBI中Blastn进行序列比对,进行生物信息学分析.
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