【摘 要】
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肠道是营养物质吸收的重要场所.在营养缺乏或应激条件下,肠道细胞可以通过自噬作用消化自身细胞器或大分子成分获得能量以维持生存.谷氨酰胺(Gln)是肠上皮细胞的主要能量来源,Gln缺乏可导致小肠黏膜萎缩、绒毛变稀变矮,屏障功能下降.精氨酸(Arg)是机体最大的供氮氨基酸,参与机体蛋白质的合成,而且是机体脯氨酸、谷氨酸/谷氨酸胺和多胺等物质的合成前体,日粮中大约40％的精氨酸在小肠内直接被分解消化.亮氨
【机 构】
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中国农业大学,动物营养学国家重点实验室,北京100193
【出 处】
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中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会
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肠道是营养物质吸收的重要场所.在营养缺乏或应激条件下,肠道细胞可以通过自噬作用消化自身细胞器或大分子成分获得能量以维持生存.谷氨酰胺(Gln)是肠上皮细胞的主要能量来源,Gln缺乏可导致小肠黏膜萎缩、绒毛变稀变矮,屏障功能下降.精氨酸(Arg)是机体最大的供氮氨基酸,参与机体蛋白质的合成,而且是机体脯氨酸、谷氨酸/谷氨酸胺和多胺等物质的合成前体,日粮中大约40％的精氨酸在小肠内直接被分解消化.亮氨酸(Leu)作为蛋白质合成底物,特别是作为营养信号分子,在蛋白质周转、调节和能量代谢等方面都具有重要的生物学功能.已有研究发现总氨基酸的缺乏能引起强烈的自噬现象,但单个氨基酸缺乏情况犹未可知.本研究旨在探讨Gln、Arg、Leu缺乏对肠道细胞增殖及自噬形成的影响规律,为深入开展营养素感应的信号通路研究奠定基础.试验采用含有5％胎牛血清、不含Gln、Arg、Leu的特殊DMEM、5μg/ml胰岛素、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素配制溶液,加入500μmol/L Gln、125 μmol/L Arg及250μmol/L Leu配制成基础培养基,培养猪肠道上皮细胞IPEC-J2 .接种104个细胞/孔至96孔板,培养36h后分别更换基础培养基和Gln缺乏、Arg缺乏、Leu缺乏的培养基继续培养8h,每个处理10个重复,CCK-8染色计算细胞数目.接种105个细胞/孔至六孔板,处理同上,每个处理3个重复,收集培养上清液和细胞.上清液通过HPLC作氨基酸分析；提取细胞总蛋白,westem blot检测自噬关键蛋白LC3-Ⅱ的表达水平.研究发现经Gln缺乏、Arg缺乏和leu缺乏的培养基培养8h后,IPEC-J2的细胞数目分别减少(29.9±2.4)％、(12.8±2.9)％及(8.0±3.9)％ (P＜0.0001).Western blot检测结果显示三处理组细胞LC3-Ⅱ表达量均显著增加,分别为对照组的(5.1±0.5)倍、(3.1±0.8)倍和(2.0±0.5)倍(P＜0.05).培养后上清中含量显著变化的氨基酸有Asp、Glu、Gln、Arg、Leu (P＜0.000 1)、Asn、Thr和Orn (P ＜0.05).以上结果表明Gln、Arg、Leu缺乏均能诱导猪肠道上皮细胞IPEC-J2产生自噬作用.细胞在氨基酸缺乏时发生自噬,可能是细胞的一种保护机制,但持续或过度的刺激也会导致细胞自噬性的死亡.与前人的研究结果稍有不同的是,Leu缺乏并没有引起严重的细胞自噬.Gln是猪小肠吸收后状态的动脉血中存在的唯一氨基酸形式,是体外培养的小猪肠上皮表面终末分化细胞的一种主要能量底物,并且是合成嘌呤和嘧啶核苷酸的必要前提,是细胞增殖所必需的.Gln缺乏组细胞数目显著减少以及LC3-Ⅱ的显著高表达也提示了Gln在猪肠道细胞中的重要作用.
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