论文部分内容阅读
目的: 建立人乳头瘤病毒16型E5基因的无性繁殖系，为进一步研究其致癌机理作准备.
方法: 用PCR技术从HPV16基因组中扩增出295bp的E5基因序列，连接到pGEM-T中介载体，经PCR鉴定并序列测定，将阳性的重组pGEM-T用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切并回收目的片段纯化备用.用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切表达载体pcDNA3质粒DNA，纯化后与HPV E5小片段一起，加T4DNA连接酶进行连接反应，并转化到JM109菌株中，获得含HPV16 E5的重组真核表达质粒和无性繁殖系，提取重组质粒DNA，经PCR和双酶切鉴定，认为HPV16E5正确插入真核表达质粒pCDNA3的CMV启动子下游，测序结果经计算机分析与文献报道一致.
结论: 经酶切分析、PCR特异扩增和序列分析证明我们成功构建了HPV16 E5镇和表达质粒，建立了该转化基因的无性繁殖系.
讨论：高危HPV E5是一种具有转化作用的癌基因，能明显延长角化细胞的寿命，刺激NIH 3T3 细胞非锚定型生长，并与多种细胞蛋白结合，促进病毒基因组与宿主DNA的整合.对于HPV繁殖中，在宫颈癌各发展阶段中的作用，以及其转化细胞的机理，仍需进一步深入探讨，E5在HPV自然感染中起何种作用至今仍不清楚，因此对HPV16 E5的生物学特性进行广泛深入研究非常必要.E5的研究远较E6、E7为少，尤其是E5的分子克隆在国内未见报道.本室已成功建立HPV16 E5基因的原核表达株，对真核表达pcDNA3-E5克隆的构建，将为制备特异性核酸探针，检测E5基因在正常和病变组织中的存在状态、基因的表达水平、以及分子流行病学的研究提供了材料，为深入了解E5的免疫学特性、生物学功能、病原学诊断及E5疫苗的研制做好了准备.