【摘 要】
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基于同源的短链醇脱氢酶基因设计引物,以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GZM1.49基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到编码短链脱氢酶的基因pfd.将该基因片段克隆到pMD-18
【机 构】
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浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江省杭州市,310014
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基于同源的短链醇脱氢酶基因设计引物,以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GZM1.49基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到编码短链脱氢酶的基因pfd.将该基因片段克隆到pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-pfd并进行测序.测序结果表明,该基因pfd全长684bp,编码228个氨基酸.BLAST分析显示该序列与荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf-5的短链脱氢酶基因(YP257867.1)有着91％的同源性.通过同源建模对其进行3D结构模拟分析,发现pfd存在两个高度保守的基序:与NAD(P)(H)结合的N端GXXXGXG基序和与催化活性相关的YXXXK基序,属于经典短链醇脱氢酶类.经测序正确后,将获得的短链脱氢酶pfd基因与表达载体pET-28b连接,构建得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-pfd.在IPTG诱导下,携带pET-pfd的E.coli BL21(DE3)高效表达分子量约为28kD的蛋白.通过IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等产酶因素优化考察,得到最佳培养条件为:37℃培养至OD600为0.6时,添加0.3mMIPTG 28℃诱导8小时。
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