人源化含硒单链抗体酶的设计、表达及纯化

来源 :2007生物物理联合会议、2007全国生物物理学科普教育研讨会、2007首届沪港粤生物物理学术会议、第四届全国医学生物物 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yoki1120
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活性氧(Reactie Oxidatie Species,ROS)是由需氧细胞在代谢过程中产生的,并会导致很多疾病。在正常条件下,机体ROS的产生和清除处于平衡状态。但在某些病理状态下,ROS的产生和清除不平衡时,过多ROS会损伤细胞的组分,如DNA、RNA、蛋白质和脂类,甚至导致疾病,如再灌注损伤、炎症、衰老、细胞凋亡和癌症。 本文首次将经化学诱变后具有高GPX活力的鼠源单链抗体进行改型。在蛋白质数据库(PDB)中,通过同源序列分析分别确定与重链和轻链同源性较高的人源抗体,对于鼠源单链抗体的改造,除了完全保留CDR区外,还通过计算机模拟的抗原结合位点的空间结构,确定与CDR结构在空间上有关的氨基酸残基,并与人同源抗体该部位的氨基酸同时成对保留,构建了人-鼠嵌合的人源化单链抗体库。通过噬菌体抗体库的筛选获得了ELISA信号较高的噬菌体阳性克隆B14,PCR方法扩增目的基因并将其克隆至表达载体pPeIB中,在E.coli.Rnsetta中进行蛋白的表达,对表达的蛋白进行分离、纯化及鉴定,然后用化学突变法引入催化基团硒代半胱氨酸(Sec),酶活测定结果表明其GPx活力为880 U/μmol,活力没有预期的高。提取质粒经DNA测序结果表明,有3个核苷酸与设计的位点不同,分别是位于VL区G1n27、Va190和VH区Lys13,分析其较低的GPx活力是由于DNA序列发生了改变,使ScFv的空间构象发生了改变,才导致GPx酶活力不高。
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